Cell|跟着院士团队学习斑马鱼胚胎显微注射

核孔复合物(Nuclear pore complexes, NPCs)是嵌于核膜上的蛋白质和RNA核质转运通道。研究表明，在不同细胞类型的不同有丝分裂阶段，NPCs的组成、结构和货物选择性/渗透性是动态变化的。NPCs在单个核中也表现出成分和构象异质性。然而，在脊椎动物早期胚胎发生过程中。NPCs的组成、结构和渗透性是否动态变化并影响胚胎发育尚不清楚。

2022年12月22日，清华大学孟安明院士课题组于Cell（IF:66.85）上发表了题为 Comprehensive maturity of nuclear pore complexes regulates zygotic genome activation的研究成果，发现了核孔复合体综合成熟度调控合子基因组激活的新机理。

该团队利用斑马鱼模型研究了NPCs的组成、结构和功能的动态变化，及母体转录因子的核转运及其与早期胚胎发生合子基因组激活（ZGA）的相关性。研究发现，核孔复合体综合成熟度主要与NPC平均大小、组成和渗透性有关，它控制着母体转录因子转运和ZGA时机。

胚胎显微注射与处理

一、胚胎显微注射

胚胎显微注射是该领域研究最核心基础的技术，让我们一起来看下该研究团队进行胚胎显微注射的具体信息吧！
【注射对象】：1c阶段的野生型斑马鱼胚胎。
【注射部位】：胚胎卵裂球细胞中（受精卵早期的细胞分裂称为卵裂，卵裂产生的子细胞呈球形，称卵裂球）。
【注射物质】：质粒、mRNA、gRNA、蛋白质和水溶性化学物质。
【注射用量】：1.实验目的为转基因：质粒 10~30pg/胚胎，转座酶mRNA 100pg/胚胎。
2.实验目的为mRNA过表达：不固定。
3.实验目的为CRISPR/Cas9基因敲除：gRNAs 50pg/胚胎，1/20稀释的商品化Cas9 NLS蛋白*。
4.化学药物处理：不固定。

小贴士：
*Cas9 NLS (SpCas9-NLS)，即含有核定位信号的CRISPR-associated endonuclease Cas9。Cas9 NLS在Cas9蛋白的N端和C端都含有SV40 T抗原的核定位序列(Nuclear localization signal or nuclear localization sequence, NLS)，使Cas9与gRNA形成的复合物在转染进入细胞后、能迅速地从细胞质进入到细胞核内，从而大大地提高了基因编辑的效率。Cas9 NLS可以通过显微注射、电穿孔和脂质体介导等方法进入细胞，而这种不需要使用DNA的系统不会产生外源DNA整合至细胞基因组的风险。
碧云天刚上架不久的Cas9 NLS(SpCas9-NLS)（D0513）是基于碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的。经验证，本产品与N公司(Competitor)的Cas9 NLS具有相当的酶活性，是您不错的选择哦！

二、胚胎处理
该研究主要研究对象为核孔复合物，因此抑制出核转运是必要的研究手段。
【处理对象】：有绒毛膜的斑马鱼胚胎（受精后30分钟）。
【处理物质】：Leptomycin B (出核转运抑制剂)*（Beyotime, S1726）
【药物浓度】：370nM(从370 mM乙醇原液中1:1000稀释到Holtfreter's溶液中)
【干预时间】：受精后30分钟进行干预直到收集进行接下来的实验。

小贴士：
*Leptomycin B简称LMB，是一种常用的出核转运(nuclear export)抑制剂，也是一种重要的出核转运的研究工具。Leptomycin B可以直接和CRM1结合，从而抑制CRM1和带有出核信号(nuclear export signal)的蛋白结合，最终导致由CRM1介导的出核转运的抑制。Leptomycin B是一种不饱和支链脂肪酸，可以通透细胞，抑制细胞核向细胞浆的蛋白转运。

使用产品

该研究除了使用了碧云天Leptomycin B (出核转运抑制剂)这款产品，也使用了碧云天经典王牌产品BCA蛋白浓度测定试剂盒。此外，小编也强烈推荐使用碧云天新研发上架的Cas9 NLS(SpCas9-NLS)（D0513）哦~

产品信息：

产品编号	产品名称	产品包装
S1726-10μg/50μg	Leptomycin B (出核转运抑制剂)	0.2mg/ml×0.05ml/0.2mg/ml×0.25ml
P0012S	BCA蛋白浓度测定试剂盒	200次
D0513S/M	Cas9 NLS (SpCas9-NLS)	500pmol/2500pmol