一网打尽！快速了解细胞活性与增殖检测常用方法！
细胞增殖是生命体的重要生命特征，是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础，细胞增殖能力是反应细胞活性的重要指标。细胞增殖最直观的表现是细胞分裂，即由原来的一个亲代细胞变为两个子代细胞，从而使细胞数量增加。各种细胞在分裂之前，都需要经过一定的物质准备。物质准备和细胞分裂是一个高度受控的相互连续的过程。这一相互连续的过程即为细胞增殖。
对细胞活性与增殖的检测可以直观的反应细胞生长状态，以及相关化合物或外界刺激所产生的细胞毒性，是生命科学相关领域中最基础的研究手段之一。
目前常用的细胞活性与增殖检测方法主要分为以下几类：
细胞计数
细胞计数是检测细胞活性的基础方法之一，利用计数板或计数仪得出细胞数目，操作简单，可用于绘制细胞生长曲线，但是却无法区分增殖细胞和非增殖细胞，且手工计数耗时较久，因此并不适合样品量多的情况。
MTT、WST-1、CCK-8
这三种检测方法原理基本相同，都是利用细胞线粒体内的一些脱氢酶将检测试剂还原为有色产物，随后利用酶标仪测量相应OD值，在一定范围内，OD值与活细胞数目成正比，从而反应细胞活性情况。
MTT是一种四唑盐，其所生成的还原产物不溶于水，并且对细胞毒性较大，因此在一定程度上限制了其应用。目前常用的CCK-8试剂盒所选用的检测试剂为WST-8，它是MTT的一种升级替代产品，与MTT或其它MTT类似产品相比，WST-8检测灵敏度更高、更易溶解、并且更加稳定。因此相关试剂盒产品具有背景吸光度低、线性范围宽、检测灵敏度高；操作简单，免去细胞洗涤步骤；细胞毒性小，针对不同样品可多次测定选取最佳测定时间等优点。
图1. WST-8检测原理图 (EC=electron coupling reagent，即电子耦合试剂)
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| C0009S/M | MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 | 500次/2500次 |
| C0035 | WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 | 100次 |
| C0036/L | WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 | 500次2500次 |
| C0037 | Cell Counting Kit-8 (CCK-8试剂盒) | 100次 |
| C0038 | Cell Counting Kit-8 (CCK-8试剂盒) | 500次 |
| C0039 | Cell Counting Kit-8 (CCK-8试剂盒) | 2500次 |
| C0040 | Cell Counting Kit-8 (CCK-8试剂盒) | 10000次 |
| C0041 | Enhanced Cell Counting Kit-8 (增强型CCK-8试剂盒) | 100次 |
| C0042 | Enhanced Cell Counting Kit-8 (增强型CCK-8试剂盒) | 500次 |
| C0043 | Enhanced Cell Counting Kit-8 (增强型CCK-8试剂盒) | 2500次 |
| C0046 | Enhanced Cell Counting Kit-8 (增强型CCK-8试剂盒) | 10000次 |
LDH测定
乳腺脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)是一种常用的细胞毒性检测指标。当细胞发生凋亡或坏死时，由于细胞膜结构被破坏导致细胞浆内的酶被释放出来，其中就包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶。LDH释放是判断细胞膜完整性的重要指标，通过检测培养液中LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。
检测原理：
在乳酸脱氢酶的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和INT (2-p-iodophenyl-3-
nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)催化反应生成NAD+和强生色物甲臜(formazan)，在490nm波长下产生吸收峰，从而可以通过比色来定量乳酸脱氢酶的活性。吸光度与乳酸脱氢酶活性成线性正相关。
图2. 乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒原理示意图
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| C0016 | 乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒 | 100次 |
| C0017 | 乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒 | 500次 |
荧光探针
CFDA-SE
CFDA-SE是一种具有细胞膜通透性的荧光染料，进入细胞后可以被细胞内的酯酶催化分解为CFSE，CFSE可以偶发性地(spontaneously)并不可逆地和细胞内蛋白的Lysine残基或其它氨基发生结合反应，并标记这些蛋白。在加入荧光探针CFDA SE后大约24小时，即可充分标记细胞。被CFDA SE标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数个月。CFDA SE标记细胞的荧光非常均一，比以前使用的其它细胞示踪荧光探针例如PKH26的荧光更加均一，并且分裂后的子代细胞的荧光分配也更均匀。
图3. CFDA-SE标记细胞原理图。
CFDA SE标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞增殖检测。最常用于淋巴细胞的增殖检测，也可以用于成纤维细胞、NK细胞等其它细胞的增殖检测，甚至还可以用于细菌增殖的检测。CFDA SE标记的细胞也可以用荧光显微镜进行观察，但由于每增殖一次细胞荧光减弱一半，在镜下较难区分荧光减弱一半的细胞，因此更加推荐采用流式细胞仪进行分析。
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| C0051 | CFDA SE细胞增殖与示踪检测试剂盒 | 2000次 |
Calcein AM
另一种常用的活细胞标记荧光探针为Calcein AM，它是在Calcein (钙黄绿素)的基础上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基团，从而增强了其疏水性，因此能够很容易穿透活细胞膜，被细胞内的酯酶水解后生成具有绿色荧光的Calcein分子，从而标记细胞。
与其它同类探针相比，由于Calcein AM的细胞毒性非常低，几乎不会影响细胞功能如细胞增殖或淋巴细胞的趋化性等，而且对pH值敏感性低，所以Calcein AM是目前活细胞荧光染色的最理想探针之一。
图4. Calcein AM细胞活性检测试剂盒与碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)联合使用检测L-929活细胞与死细胞的效果图。
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| C2012-0.1ml | Calcein AM (钙黄绿素AM) | 2mM×0.1ml |
| C2012-0.5ml | Calcein AM (钙黄绿素AM) | 2mM×0.5ml |
| C2013S/M/L | Calcein AM细胞活性检测试剂盒(CCK-F) | 100次/500次/2500次 |
| C2015S/M/L | Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒 | 100次/500次/2500次 |
DNA合成测定
直接检测细胞中DNA合成情况被认为是最精准的检测细胞增殖方法之一。最初广泛使用的方法是放射性标记核苷掺入法，如如氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷([3H]thymidine)掺入法。但是该方法具有放射性污染，并且很难实现单细胞检测，因此使用受到很大限制。目前较为常用的检测方法为BrdU法或EdU法。
BrdU，即5-溴脱氧尿嘧啶核苷，是一种胸腺嘧啶的衍生物，可以代替正常的胸腺嘧啶参与细胞DNA复制过程，随后利用BrdU特异性抗体检测BrdU的掺入情况，从而检测DNA合成情况。BrdU法中为了使大分子的BrdU特异性抗体进入细胞并且与DNA上的BrdU结合，需要对双链DNA进行变性处理（例如酸变性、热变性或DNase消化等），这种变性可能会影响细胞形态，影响后续的免疫荧光和免疫组化检测、DNA荧光染色等。
EdU，中文名为5-乙炔基-2'-脱氧鸟苷，是一种新型胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，同样可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中。并且EdU上的乙炔基能够与荧光标记的小分子叠氮化物探针通过“点击反应”形成稳定的三唑环，从而标记新合成的DNA分子。与BrdU法相比，EdU法无需DNA变性，只需简单的固定通透就能够使小分子探针进入细胞，标记DNA分子，检测到单个细胞的增殖情况。
图5. BrdU法和BeyoClick™ EdU法检测原理的比较。
图6. HeLa细胞用BeyoClick™ EdU-488细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖的效果图。
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| C0071S/L | BeyoClick™ EdU-488细胞增殖检测试剂盒 | 50-500次/200-2000次 |
| C0075S/L | BeyoClick™ EdU-555细胞增殖检测试剂盒 | 50-500次/200-2000次 |
| C0078S/L | BeyoClick™ EdU-594细胞增殖检测试剂盒 | 50-500次/200-2000次 |
| C0081S/L | BeyoClick™ EdU-647细胞增殖检测试剂盒 | 50-500次/200-2000次 |
| C0085S/L | BeyoClick™ EdU细胞增殖检测试剂盒(DAB法) | 50-500次/200-2000次 |
| C0088S/L | BeyoClick™ EdU细胞增殖检测试剂盒(TMB法) | 500次/2000次 |
ATP含量检测
ATP是细胞能量的基本来源，在细胞多种生理过程中发挥重要作用，是细胞新陈代谢的一个重要指标。当细胞死亡时，ATP会迅速水解。因此ATP含量与活细胞数目之间具有良好的线性关系。
借助ATP依赖的萤光素酶催化的萤光素发光反应，ATP可以通过测定化学发光强度来进行定量。由于ATP含量能很好地反映活细胞的数目，而ATP含量和化学发光强度成正比，这样就可以简单地通过化学发光强度来计算出细胞活力或细胞数目。
依据此原理，碧云天推出CellTiter-Lumi™系列发光法细胞活力检测试剂盒产品，该系列产品能够通过化学发光法测定细胞内ATP含量，从而用于超高灵敏度、超高信号稳定性、超宽线性范围定量检测活细胞数目。
图7. CellTiter-Lumi™ 系列发光法细胞活力检测试剂盒检测ATP的原理图。
图8.CellTiter-Lumi™ Steady Plus发光法细胞活力检测试剂盒(CTL Steady Plus)和同类产品CellTiter-Lumi™ Plus发光法细胞活力检测试剂盒(CTL Plus)对不同细胞的检测效果。
该方法最大的优点在于检测灵敏度特别高，可以检测到低至约12个细胞，并且检测速度非常快(约十分钟就可完成一个96孔板的检测)，特别适合用于高通量检测。CTL和CTL Plus两者相比，CTL Plus的检测上限更高，线性范围更宽，并且发光值随时间的稳定性也更高一些。其中CellTiter-Lumi™ Steady系列的两款产品最大的特点是发光信号特别稳定，1小时内信号整体上下波动范围通常不超过±10%，特别适用于待测样品数量较多、耗时较长且须前后数据进行比较的多孔板中细胞活力的大批量连续测定，也特别适用于高通量筛选(high-throughput screening)的自动化操作系统。
CellTiter-Lumi™系列各个产品的对比见下表：
| 产品编号 | CellTiter-Lumi™发光法细胞活力检测试剂盒 | CellTiter-Lumi™ Plus发光法细胞活力检测试剂盒 | CellTiter-Lumi™ Steady发光法细胞活力检测试剂盒 | CellTiter-Lumi™ Steady Plus发光法细胞活力检测试剂盒 |
| 产品简称 | CTL | CTL Plus | CTL Steady | CTL Steady Plus |
| 产品编号 | C0065 | C0068 | C0069 | C0070 |
| 主要用途 | 通过化学发光法用于超高灵敏度、超宽线性范围定量检测活细胞活力 | |||
| 使用便捷程度 | 非常方便 | 非常方便 | 非常方便 | 非常方便 |
| 检测灵敏度 | 非常灵敏 | 非常灵敏 | 非常灵敏 | 非常灵敏 |
| 线性范围 | 10-30,000个(HeLa细胞) | 10-100,000个(HeLa细胞) | 10-30,000个(HeLa细胞) | 10-50,000个(HeLa细胞) |
| 信号强度 | 最高 | 特别高 | 高 | 非常高 |
| 信号稳定性 | 较稳定 | 非常稳定 | 特别稳定 | 特别稳定 |
| 产品稳定性 | 非常稳定 | 非常稳定 | 非常稳定 | 非常稳定 |
| 性价指数 | ★★★★★ | ★★★★ | ★★★★★ | ★★★★ |
| 推荐指数 | ★★★★ | ★★★★★ | ★★★★ | ★★★★★ |
同时，我们还推出了2.0冻干粉版本的产品——CellTiter-Lumi™ II发光法细胞活力检测试剂盒系列产品，与CTL系列相比，二者检测效果完全一致，唯一不同的是II代产品为冻干粉版本，在-20℃保存特别稳定！
CellTiter-Lumi™ II系列各个产品的对比见下表：
| 产品名称 | CellTiter-Lumi™发光法细胞活力检测试剂盒 | CellTiter-Lumi™ II发光法细胞活力检测试剂盒 | CellTiter-Lumi™ Plus II发光法细胞活力检测试剂盒 | CellTiter-Lumi™ II Steady发光法细胞活力检测试剂盒 | CellTiter-Lumi™ Steady Plus II发光法细胞活力检测试剂盒 |
| 产品简称 | CTL | CTL II | CTL Plus II | CTL Steady II | CTL Steady Plus II |
| 产品编号 | C0065 | C0056 | C0057 | C0058 | C0059 |
| 主要用途 | 通过化学发光法用于超高灵敏度、超宽线性范围定量检测活细胞活力 | ||||
| 使用便捷程度 | 非常方便 | 比较方便 | 比较方便 | 比较方便 | 比较方便 |
| 检测灵敏度 | 非常灵敏 | 非常灵敏 | 非常灵敏 | 非常灵敏 | 非常灵敏 |
| 线性范围 | 10-30,000个(HeLa细胞) | 10-30,000个(HeLa细胞) | 10-100,000个(HeLa细胞) | 10-30,000个(HeLa细胞) | 10-50,000个(HeLa细胞) |
| 信号强度 | 最高 | 最高 | 特别高 | 高 | 非常高 |
| 信号稳定性 | 较稳定 | 较稳定 | 非常稳定 | 特别稳定 | 特别稳定 |
| 产品稳定性 | 非常稳定 | 特别稳定 | 特别稳定 | 特别稳定 | 非常稳定 |
| 性价指数 | ★★★★★ | ★★★★★ | ★★★★ | ★★★★★ | ★★★★ |
| 推荐指数 | ★★★★ | ★★★★ | ★★★★★ | ★★★★ | ★★★★★ |
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| C0065S/M/L/XL | CellTiter-Lumi™发光法细胞活力检测试剂盒 | 100次/500次/2500次/10000次 |
| C0068S/M/L/XL | CellTiter-Lumi™ Plus发光法细胞活力检测试剂盒 | 100次/500次/2500次/10000次 |
| C0069S/M/L/XL | CellTiter-Lumi™ Steady发光法细胞活力检测试剂盒 | 100次/500次/2500次/10000次 |
| C0070S/M/L/XL | CellTiter-Lumi™ Steady Plus发光法细胞活力检测试剂盒 | 100次/500次/2500次/10000次 |
| C0056S/M/L/XL | CellTiter-Lumi™ II发光法细胞活力检测试剂盒 | 100次/500次/2500次/10000次 |
| C0057S/M/L/XL | CellTiter-Lumi™ Plus II发光法细胞活力检测试剂盒 | 100次/500次/2500次/10000次 |
| C0058S/M/L/XL | CellTiter-Lumi™ Steady II发光法细胞活力检测试剂盒 | 100次/500次/2500次/10000次 |
| C0059S/M/L/XL | CellTiter-Lumi™ Steady Plus II发光法细胞活力检测试剂盒 | 100次/500次/2500次/10000次 |
细胞膜通透性测定
活细胞具有完整的细胞膜结构，因此对于某些特定染料如台盼蓝、伊红等具有一定的排斥能力，而死细胞由于细胞膜破损，则可以被这些染料着色，因此可在染色后，通过显微镜观察计数，确定细胞存活数量。
图9. 细胞台盼蓝染色效果图。
此外，中性红作为一种pH指示剂，也常被用于细胞活性检测。活细胞对中性红具有一定的摄入能力，在生理pH条件下，中性红染料能够通过非离子被动扩散的方式穿透细胞膜，并且在溶酶体中积累。当细胞受到损伤时，对中性红的摄入能力就会下降。因此可以通过测定一段时间内细胞对中性红的摄入量，确定细胞的增殖或毒性情况。
图10. L929细胞中性红染色效果图
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| C0011 | 台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒 | 100次 |
| C0013 | 中性红细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 | 500次 |
碧云天各种细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒的比较和选择，请参考
http://www.beyotime.com/support/cell-proliferation.htm