CELL|碧云天产品助力新生儿胆道闭锁肝损伤机制及治疗研究

胆道闭锁（biliary atresin, BA）是免疫介导的肝外和（或）肝内胆管阻塞，导致病理性黄疸以及肝硬化和肝衰竭等严重危机婴幼儿生命的疾病。BA发病期在新生儿阶段，发病率与儿童期各种肿瘤发病率之和相当。BA的治疗以肝门肠吻合术（葛西手术）为主，但术后仍有超过一半的患儿需要进行肝移植手术，未进行肝移植的患儿则会出现反复胆管炎症、门静脉高压、食管静脉曲张性出血、肝性骨营养不良等症状。

2020年11月27日，广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心儿科研究所的张玉霞教授团队与该中心外科实验室的温哲教授、夏慧敏教授团队、以及北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、生命科学学院的白凡教授团队联合在《Cell》杂志以研究长文的形式发表题为“ Liver immune profiling reveals pathogenesis and therapeutics for biliary atresia ”的研究论文。该研究通过单细胞转录组学、动物及临床试验系统描绘了BA患儿的肝脏免疫图谱，并通过临床试验发现，利妥昔单抗能够使得BA患儿肝脏免疫系统紊乱恢复健康状态，对BA患儿肝硬化和肝衰竭的免疫病理机制及治疗方案提供了新的理论观点。

研究人员对一万多份临床样本进行了统计分析，其中包含健康对照2471份、生理学黄疸9297份、胆总管囊肿248份以及胆道闭锁927份，分析结果证实，BA患儿存在明显的谷氨酰转肽酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆红素及总胆汁酸水平升高，即存在持续性肝损伤。为了进一步了解相关病理机制，研究人员对其中6例BA患儿的活检肝组织样本以及10例对照肝组织样本进行了单细胞测序，并对T细胞和B细胞进行了V(D)J测序。
研究发现在BA患儿的肝脏中，具有细胞毒性作用的cTh1和ex-cTh17细胞显著增多，TCR分析显示，与对照组相比，BA患儿肝脏中ex-cTh17向cTh1分化增多， ROR-γt ⁺ IFN-γ⁺ ex-cTh17 细胞比例也有所增加。除了CD4 T细胞，IL-17⁺ γδT (ex- γδT17) 和IL-17⁺ MAIT (ex-MAIT17) 同样表现出Th1特征，说明BA患儿肝脏微环境的改变会促进Th17向Th1的分化。同时，BA患儿肝脏内CD8⁺效应T细胞比例显著增加，CX3CR1⁺CD8Teff到CD8Trm的分化显著增多，具有免疫保护以及抑制成纤维作用的CX3CR1⁺ CD8Teff细胞比例及其CX3CR1表达量显著降低。

肝星状细胞能够分泌趋化因子CX3CL1，从而介导CX3CR1⁺的淋巴细胞、Kupffer细胞及单核巨噬细胞的募集和粘附，缺失CX3CL1会导致TNF-α和TGF-β的大量分泌，从而激活肝星状细胞并促进肝脏纤维化。研究人员发现BA患者肝内CX3CR1⁺ CD8Teff比例显著减少，通过共培养实验证实该细胞能够抑制肝星状细胞促纤维化基因的表达，因此BA患者肝内该细胞的减少会促进肝纤维进程。同时研究人员发现在BA患儿肝脏中CX3CR1⁺循环NK细胞（cir-NK）和循环NKT细胞（cir-NKT）比例显著降低，同时CX3CL1浓度也明显减少，这些发现都提示在BA肝脏中具有抑制肝脏纤维化作用的CX3CR1⁺CD8Teff和NK细胞减少可能与细胞本身趋化能力降低以及肝脏趋化因子减少有关。

研究人员还发现在新生儿肝脏中依旧存在血细胞生成现象，研究人员利用Bulk RNAseq方法研究发现在肝脏和骨髓中，各个阶段的B细胞在其对应的发育阶段转录谱几乎相同。流式和免疫荧光染色液显示肝脏中确实存在B细胞前体细胞。研究者认为肝脏B细胞的耐受性缺失可能是导致BA肝脏损伤的重要原因。通过一系列分析，发现BA患儿的记忆 B细胞、浆母细胞和浆细胞的BCR具有自身反应性的特征，并且它们的抗体类型转换也明显受到抑制。通过免疫球蛋白浓度的测量证实BA患者肝脏具有保护性质的 IgM特异性自身抗体浓度降低，而具有损伤作用的IgG特异性自身抗体浓度升高，并且患者无黄疸的存活时间与IgM/IgG4比值有正相关关系。

考虑到B细胞还能够通过MHC介导的抗原呈递以及可溶性介质调节T细胞、NK细胞和骨髓细胞功能，研究人员利用RRV诱导的BA小鼠模型验证了B细胞修饰疗法对于BA肝损伤的治疗效果。结果显示，anti-CD20抗体组和anti-MHC组均可显著减少黄疸发生，同时BA鼠肝脏内CX3CL1浓度也显著升高，Kuppfer细胞数目及功能均得到恢复，肝脏内淋巴细胞浸润减少、肝纤维化程度缓解。基于此，研究人员开展了相应的试验性临床研究，试验招募了4名BA患儿参与治疗，给予利妥昔单抗后，外周血和肝脏来源的成熟B细胞被有效清除，用药2-3个月后，B细胞恢复正常水平。与对照组相比，利妥昔单抗治疗后4名受试者体内自身抗体浓度降低，肝脏活检样本测序结果显示CD20⁺B细胞被清除，而RAG1/2 ⁺ B细胞和成熟的浆细胞并未受到影响。此外，利妥昔单抗的使用降低了BA肝脏中CD8Trm细胞的比例和扩增， CX3CR1⁺ CD8Teff和CD8Trm之间的转分化也明显减少。转录组比较分析发现使用利妥昔单抗的患者CX3CR1⁺ CD8Teff细胞中CX3CR1和GZMA/B表达增强、CD8Trm细胞中的IFNG表达降低、单核巨噬细胞的炎症反应性和清道夫功能以及cTh17细胞中Th17特征基因的表达增高。因此，研究人员认为短暂的B细胞清除可能可以作为恢复BA婴儿肝免疫稳态的术前或术后策略。

在研究中，研究人员选用了多种碧云天高品质试剂，用于蛋白定量及免疫沉淀检测，包括BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、ChIP Assay Kit、0.5M EDTA。

产品编号	产品名称	产品包装
ST066	0.5M EDTA, pH8.0	100ml
P2078	ChIP Assay Kit	22次
P0010	BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)	500次
P0010S	BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)	200次

论文链接：
Wang et al., Liver Immune Profiling Reveals Pathogenesis and Therapeutics for Biliary Atresia, Cell (2020)
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.10.048