Cell:碧云天产品助力全能干细胞诱导新方法研究
全能性干细胞通常指具有最高分化潜能的干细胞，其能够最终分化发育成为各种组织器官。而多能性干细胞虽然同样具有分化出多种细胞组织的潜能，但却不具备发育成完整个体的能力。自成功分离出首个多能性胚胎干细胞后，如何确保体外培养的干细胞能够在功能上和分子构成上与体内的胚胎干细胞保持一致始终是一个急需解决的问题。
2021年5月14日，北京大学杜鹏团队在《Cell》杂志表题为“Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression”的研究论文。研究人员通过抑制剪接体，成功诱导了小鼠ESCs多能性向全能性的转变，实现了全能性干细胞的体外建立和培养，并且由于其在分子构成和功能上与2细胞和4细胞卵裂球相近，因此被命名为全能性卵裂球样细胞（TBLCs）。单细胞RNA测序等分析结果表明TBLCs具有双向分化能力，该研究为全能干细胞的获取和培养提供了新的方法。
文章摘要：Since establishment of the first embryonic stem cells (ESCs), in vitro culture of totipotent cells functionally and molecularly comparable with in vivo blastomeres with embryonic and extraembryonic developmental potential has been a challenge. Here we report that spliceosomal repression in mouse ESCs drives a plurip otent-to-totipotent state transition. Using the splicing inhibitor pladienolide B, we achieve stable in vitro culture of totipotent ESCs comparable at molecular levels with 2- and 4-cell blastomeres, which we call toti potent blastomere-like cells (TBLCs). Mouse chimeric assays combined with single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) demonstrate that TBLCs have a robust bidirectional developmental capability to generate mul tiple embryonic and extraembryonic cell lineages. Mechanically, spliceosomal repression causes wide spread splicing inhibition of pluripotent genes, whereas totipotent genes, which contain few short introns, are efficiently spliced and transcriptionally activated. Our study provides a means for capturing and maintain ing totipotent stem cells.
有研究表明，剪接体对于细胞转录也具有一定的调控作用，为了验证剪接体对干细胞转录调控及分化过程的影响，研究人员对于已发表的人和小鼠胚胎单细胞RNA测序结果进行了进一步分析，结果显示在早期胚胎发育过程中，有部分剪接因子的表达水平会发生变化。同时近期也有类似研究结果表明，部分剪接因子能够抑制小鼠ESCs全能性标志基因ZSCAN4s的活性，因此研究人员推测剪接体活性的动态变化也许能够调控干细胞全能性/多能性的体外转换。
为了验证此猜想，研究人员敲除了小鼠多能性ESCs中14种剪接因子，qRT-PCR及Western实验结果证实，抑制其中10种剪接因子（SNRPD2, SNRPB, ISY1, EFTUD2, LSM4, PUF60, and和SF3B2-SF3B5）的表达能够明显激活全能性标志基因ZSCAN4s和MERVL的表达。随后研究人员利用poly(A)+RNA测序分析了总体转录组的变化，结果显示，抑制剪接体不仅会激活全能性标志基因的表达，同时还会抑制POU5F1、NANOG、SOX2和ZFP42等多能性因子的表达。上述研究结果表明剪接体是调控ESCs命运的关键因子，抑制剪接因子能够激活多能性干细胞中全能性基因的表达，从而促进PSCs由多能性向全能性转化。
由上述结果可知，抑制剪接因子SF3B亚基能够激活全能性标志基因的表达，因此研究人员选取了SF3B的天然抑制剂PladienolideB（PlaB）并将其添加到Serum/LIF培养基中，结果显示2.5nM和5.0nM的PlaB均能够有效诱导全能性基因的表达。研究人员采用含有2.5nM PlaB的SLP培养基培养携带特定报告基因的小鼠ESCs，荧光分析结果显示，培养一段时间后，小鼠ESCs中全能性基因荧光强度均出现了减弱；测序分析结果同样表明与P0期相比，ZSCAN4s, DDIT4L, PLK2, BTG1/2和ZFP352等多种全能性干细胞标志基因表达均出现了上调，而SOX2, DPPA5A, ZFP42, TET1和TCF15等多能性标志基因则出现了明显下调。诸多实验结果结果显示使用SLP培养基，不仅能够促进小鼠PSCs向TBLCs转化，同时也实现了TBLCs的体外培养，在多次传代后依旧能维持其染色质稳定性和细胞活性。当使用不添加PlaB的正常培养基后，TBLCs细胞也能够重新转变为多能性状态，说明干细胞多能-全能转换受到单个剪接抑制剂PlaB的调控。
随后研究人员对PSCs和TBLCs进行了单细胞转录组测序，选取了23个多能性标记基因、30个全能性标记基因和两个转座子用于区分PSC和TBLC，结果显示SLP培养液能够很好地实现TBLCs体外培养并维持其细胞同质性。为了进一步了解TBLCs的分子表型，研究人员采取了一系列组学分析方法对TBLCs和PSCs进行了分析。Ribo-seq结果显示，与PSCs相比，TBLCs在翻译水平出现了全能性基因的明显上调和多能性标记基因的明显下调。WGBS结果显示，PSCs整体DNA甲基化水平为71%，更接近E6.5-E7.5的胚胎时期；而TBLCs基因组DNA甲基化水平与之相比减少了35%，更接近2细胞或4细胞胚胎时期，WGBS结果说明TBLCs的DNA甲基化水平与体内全能性卵裂球更为接近。ATAC-seq结果显示，TBLCs在转录起始位点附近的开放峰和封闭峰状态与小鼠2细胞和4细胞胚胎时期更为相似。上述结果均说明TBLCs与体内全能性胚胎在多组学方面均具有一定的相似性。
为了进一步验证TBLCs的分化潜能，研究人员将一定数量的EGFP标记的小鼠PSCs或TBLCs分别注入8细胞胚胎中，体外分化36-48小时监测细胞的分化情况。结果显示TBLC可以分化产生多种胚胎内和胚胎外组织，包括囊胚时期的TE、E6.5-E7.5胚胎的EPC和ExE，以及发育后期的胎盘和卵黄囊。证实了TBLC强大的双向发育潜能。
在研究中，研究人员选用了碧云天高品质Western Blot相关产品，包括RIPA裂解液、PMSF和BeyoECL化学发光试剂盒等。
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| P0013B | RIPA裂解液(强) | 100ml |
| ST506 | PMSF (100mM) | 10ml |
| P0018FS | BeyoECL Moon (极超敏ECL化学发光试剂盒) | 100ml |
| P0018FM | BeyoECL Moon (极超敏ECL化学发光试剂盒) | 500ml |
| P0018S | BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒) | 100ml |
| P0018M | BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒) | 500ml |
| P0018AS | BeyoECL Star (特超敏ECL化学发光试剂盒) | 100ml |
| P0018AM | BeyoECL Star (特超敏ECL化学发光试剂盒) | 500ml |
论文链接：
Shen H , Yang M , Li S , et al. Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression. Cell. 2021.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.020