人体由数十亿细胞组成，体内各种复杂的生命活动依赖于生物大分子之间的相互作用，其中蛋白质作为生命活动的执行者，鉴定蛋白质间的相互作用(Protein-Protein Interactions, PPIs)是阐明复杂细胞生理过程分子机制的关键。
传统的蛋白质间相互作用筛选技术：酵母双杂交(Yeast two hybrid, Y2H)和亲和纯化质谱(Affinity purification-Mass spectrometry, AP-MS)都存在局限性，例如不适用于研究膜蛋白间的相互作用，无法检测的体内蛋白质间微弱、短暂的相互作用，无法检测细胞动态变化等。
近年来，酶催化邻近标记技术(Enzyme-Catalyzed Proximity labeling-based method)作为鉴定活细胞中蛋白间相互作用的强大工具得到了越来越广泛的应用。该技术主要通过酶催化的共价修饰标记邻近蛋白，结合质谱鉴定分析进行蛋白间相互作用的筛选，很大程度上弥补了传统蛋白间相互作用筛选技术的不足。目前主要有四种酶催化邻近标记系统：BioID (Proximity-dependent biotin identification)，APEX (engineered Ascorbate Peroxidase)，HRP (Horseradish Peroxidase)和PUP-IT (Pupylation-based Interaction Tagging)。接下来，小编为大家介绍下最常用的BioID、APEX及RNA-蛋白相互作用检测的RaPID系统吧。
BioID
邻近依赖的生物素标记鉴定(Proximity-dependent biotin identification, BioID)技术是基于生物素连接酶(Biotin ligase, BirA)的R118G突变体BirA*。BirA可在ATP存在的条件下，高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5'腺苷酸(Biotinoyl-5'-AMP)，并特异性地将生物素连接到Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)的赖氨酸残基上，从而对目的蛋白进行快捷、高效的生物素标记；但由于BirA发生R118G突变，其活化的生物素酰-5'腺苷酸不再特异性修饰Avi标签的赖氨酸残基，而是可以对与其邻近的(~10nm)任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记。
图1. 碧云天邻近蛋白生物素标记质粒的工作原理图。
根据生物素连接酶来源种属的不同，BioID可以进一步分为BioID (Escherichia coli), BioID2 (Aquifex aeolicus), AirID (engineered Escherichia coli by an ancestral enzyme reconstruction algorithm with metagenomics), TurboID and mini TurboID (engineered Escherichia coli by yeast surface display)和BASU (Bacillus subtilis)。
| 来源 | 最佳反应温度 | 特点 | |
| BioID | Escherichia coli生物素连接酶的突变体 | 37℃ | 适用范围广；敏感性高；适用于可溶性差或较难纯化的蛋白；标记蛋白易纯化、背景低。 |
| BioID2 | Aquifex aeolicus生物素连接酶的突变体 | 37-55℃ | 更好的生物素标记效果；更低的生物素浓度；更宽的反应温度。 |
| AirID | 基于E.coli生物素连接酶人工改造 | 26-37℃ | 更小的细胞毒性；更低的生物素浓度；更高的酶活性；更宽的反应温度范围。 |
| miniTurboID | TurboID基础上进一步截短、突变 | 30℃（16~37℃也具有良好的标记活性） | 更好的生物素标记效果；更高的生物素连接酶活性；更宽的反应温度范围。 |
表1.部分种类的BioID对比。
为了更好的助力大家科研，碧云天基于BioID2、AirID和miniTurboID构建了N端或C端融合的邻近蛋白生物素标记质粒及其对照质粒，供大家自主选择。
产品信息：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 | 产品价格 |
| D3021-1µg/100µg | pCMV-N-Flag-BioID2 (邻近蛋白生物素标记质粒) | 1µg/100µg | / |
| D3023-1µg/100µg | pCMV-C-BioID2-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒) | 1µg/100µg | / |
| D3025-1µg/100µg | pCMV-BioID2-Flag (阴性对照质粒) | 1µg/100µg | / |
| D3027-1µg/100µg | pCMV-N-Flag-AirID (邻近蛋白生物素标记质粒) | 1µg/100µg | / |
| D3029-1µg/100µg | pCMV-C-AirID-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒) | 1µg/100µg | / |
| D3030-1µg/100µg | pCMV-AirID-Flag (阴性对照质粒) | 1µg/100µg | / |
| D3034-1µg/100µg | pCMV-N-Flag-miniTurboID (邻近蛋白生物素标记质粒) | 1µg/100µg | / |
| D3035-1µg/100µg | pCMV-C-miniTurboID-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒) | 1µg/100µg | / |
| D3037-1µg/100µg | pCMV-miniTurboID-Flag (阴性对照质粒) | 1µg/100µg | / |
| D3039-1µg/100µg | pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒) | 1µg/100µg | / |
APEX
APEX (Ascorbate Peroxidase)，中文名为抗坏血酸过氧化物酶，是基于来源于豌豆(pea)或大豆(soybean)的抗坏血酸酶经工程改造而来。在H2O2存在的情况下，APEX能快速将生物素基酪氨酰胺(Biotin-tyramide，Biotin-phenol)、生物素-4-氨基苯酚(Biotin-4-aminophenol)或生物素-萘胺(Biotin-Naphthylamine, Biotin-Nap)转化为自由基，这些自由基可以标记20nm半径内无论是直接相互作用的蛋白还是邻近的蛋白任意暴露在外富含电子的氨基酸残基(Tyr, Trp, Cys or His)，后续可通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱鉴定相互作用的蛋白。此外，APEX也常被用于电子显微镜细胞成像(Electron Microscopy, EM)，因此也被称作EM标签(EM tag)，其原理是表达APEX融合蛋白的细胞被固定后，加入DAB (3, 3'-diaminobenzidine)底物，在H2O2存在的情况下，APEX催化DAB氧化聚合交联生成局部沉淀，后续用富含密集电子的OsO4对DAB聚合物进行染色产生EM对比，后续用电子显微镜进行成像。
APEX2是APEX的改进增强版本。APEX2和APEX相比的优点有：①蛋白表达量高：APEX2在哺乳细胞中稳定性更好，因此融合蛋白表达量更高。②酶活性更高：APEX2的酶活性更高，因此可以在融合蛋白表达量较低的情况下更有效的进行邻近蛋白生物素标记和电子显微镜细胞成像。
碧云天基于APEX2生产了pCMV-N-NES-Flag-APEX2 (邻近蛋白生物素标记质粒)和pCMV-N-mito-Flag-APEX2 (线粒体邻近蛋白生物素标记质粒)供大家选择。
pCMV-N-NES-Flag-APEX2 (邻近蛋白生物素标记质粒)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中表达N端融合核外运信号(Nuclear export signal, NES)、Flag标签和APEX2的目的蛋白以用于生物素标记与其相互作用的目的蛋白的质粒。在H2O2存在的情况下，APEX2在1分钟内能快速将生物素基酪氨酰胺、生物素-4-氨基苯酚或生物素-萘胺转化为自由基，这些自由基可以标记20nm半径内无论是直接相互作用的蛋白还是邻近的蛋白任意暴露在外富含电子的氨基酸残基(Tyr, Trp, Cys or His)，后续可通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱鉴定相互作用的蛋白(图2)。
pCMV-N-mito-Flag-APEX2 (线粒体邻近蛋白生物素标记质粒)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中表达N端融合线粒体基质定位肽(Mitochondrial matrix target peptide, mito)、Flag标签和APEX2的目的蛋白以用于生物素标记与其相互作用的目的蛋白的质粒。其具体工作原理参考pCMV-N-NES-Flag-APEX2的工作原理。线粒体邻近蛋白生物素标记质粒在筛选和鉴定线粒体内的蛋白与蛋白相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用。
图2. 碧云天邻近蛋白生物素标记质粒pCMV-N-NES-Flag-APEX2的工作原理图。
产品信息：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 | 产品价格 |
| D3044-1µg /100µg | pCMV-N-NES-Flag-APEX2 (邻近蛋白生物素标记质粒) | 1µg/100µg | / |
| D3047-1µg/100µg | pCMV-N-mito-Flag-APEX2 (线粒体邻近蛋白生物素标记质粒) | 1µg/100µg | / |
RaPID
RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)是在活细胞内(in Vivo)以RNA为中心(RNA-centric)，利用生物素连接酶对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记，后续通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱或Western鉴定RNA-蛋白质间相互作用的技术(图3)。RaPID在筛选和鉴定活细胞内非编码RNA序列(Noncoding RNA sequence)：包括长链非编码RNA (Long noncoding RNA, lncRNA)、小核仁RNA (Small nucleolar RNA, snoRNA)和非翻译mRNA区域(Untranslated mRNA region)，与RNA结合蛋白(RNA-binding protein, RBP)相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用。
RaPID包括2个质粒：RaPID生物素连接酶载体(如pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag)，即RaPID protein；和RNA诱饵载体(如pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB) ，即RNA component。
pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中融合表达λN肽段、核外运信号和生物素连接酶(miniTurbo)的以用于生物素标记与RNA诱饵片段相互作用的目的蛋白的质粒。
pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (RaPID质粒)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中表达RNA诱饵片段的载体，RNA诱饵片段被2个λ噬菌体(Bacteriophage lambda)的BoxB RNA茎环结构夹在中间，其中BoxB茎环结构与λN肽段具有极高的亲和力。
图3. 碧云天RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)生物素标记质粒的工作原理图。
产品信息：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 | 产品价格 |
| D3039-1µg /100µg | pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒) | 1µg/100µg | / |
| D3040-1µg/100µg | pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (RaPID质粒) | 1µg/100µg | / |
| D3042-1µg/100µg | pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒) | 1µg/100µg | / |