RNA测序——如何释放出留在潘多拉魔盒里的希望？
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近些年来，高通量RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）的发展极大地促进了功能性小非编码RNA(small non-coding RNAs, sncRNAs)的发现。传统的用于sncRNAs测序的建库方法是基于3'和5'小RNA的接头（adapter）连接，适用于很多具有5'磷酸盐（5'-P）和3'羟基（3'-OH）的小RNA。然而，当遇到带有特定RNA修饰的sncRNAs时，传统的建库方法就无法“大展拳脚”，这些修饰就像是把RNA的秘密包裹起来，防止传统的RNA测序方法窥测到里面的“希望”。 这些“罪魁祸首”主要通过以下两种方式阻碍传统的RNA测序[1]：
  1. 干扰逆转录正常进行：主要是RNA甲基化，如m1A, m3C, m1G和m22G，会干扰逆转录正常进行，使RNA低效或不完全地转化为cDNA
  2. 阻碍接头连接：主要是3'末端修饰，如3'磷酸盐（3'-P）和2',3'环磷酸盐(2',3'-cP)，会阻碍接头连接；

AlkB、T4PNK——为RNA测序带出“希望”

AlkB

AlkB (dealkylating enzyme α-ketoglutarate-dependent hydroxylase), 是一种α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate, α-KG)和Fe(II)依赖的双加氧酶(Dioxygenase)，可以有效地修复单链或双链DNA和RNA中的各种烷基化损伤(Alkylation damage)，常被用于去除RNA中的m6A等甲基化修饰，去除DNA中的m1A、m3C、m6A等修饰，从而保证逆转录的正常进行。

碧云天生产的AlkB (RNA/DNA去甲基化酶, Nuclease-free)是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台通过大肠杆菌表达、纯化获得的不含DNase和RNase的高品质重组酶。能够高效充分地去除DNA或RNA中的甲基化(效果参考图1)。

产品效果：

图1. 碧云天生产的AlkB对HEK 293T细胞总RNA的m6A修饰的去甲基化效果图。如图所示，本产品对HEK 293T细胞总RNA的m6A去甲基化效果显著。

产品用途：

  1. RNA的m6A、m1A、m3C或m1G去甲基化；
  2. ARM-seq、PANDORA-seq等；
  3. DNA的m1A、m3C和m6A的去甲基化。

产品信息：

产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
R0639S AlkB (RNA/DNA去甲基化酶,
Nuclease-free)		 200U
R0639M AlkB (RNA/DNA去甲基化酶,
Nuclease-free)		 1000U
R0639L AlkB (RNA/DNA去甲基化酶,
Nuclease-free)		 5000U

T4 PNK

T4 PNK（T4 Polynucleotide Kinase），即T4多聚核苷酸激酶。可用于将3'-P或2',3'-cP转化为3'-OH，并添加一个5'-P，从而促进RNA测序过程中接头的连接(反应原理如图2所示)。

图2. 碧云天生产的T4 PNK Kit催化线性双链DNA的5'羟基末端磷酸化和3'磷酸末端去磷酸化的反应示意图。

碧云天生产的T4 PNK Kit (T4 Polynucleotide Kinase Kit)，即T4多聚核苷酸激酶试剂盒。本试剂盒基于T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase, T4 PNK)的激酶活性，可用于催化磷酸基团从ATP转移至单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基，实现5'端磷酸化修饰；同时可以基于T4 PNK的磷酸酯酶活性，可用于催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸的3'磷酸的脱磷酸基团的反应。

产品效果：

图3. 碧云天生产的T4 PNK Kit (D7099)催化线性双链DNA的5'羟基末端磷酸化的效果图。如图所示，本产品对线性双链DNA的5'羟基末端具有良好的磷酸化效果。

产品用途：

  1. 进行寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端标记，用作Southern、Northern、EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等；
  2. 使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；
  3. 催化3'磷酸化的单核苷酸的5'磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3'末端连接；
  4. 去除3'端磷酸基团。

产品信息：

产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7099S/M T4 PNK Kit 50次、200次 /
D7096、D7097 T4 Polynucleotide Kinase 100U、500U /
D7098S/M/L T4 Polynucleotide Kinase 500U、2000U、10000U //
D7100S/M/L T4 Polynucleotide Kinase (3'phosphatase minus) 500U、2000U、10000U //

参考文献：

[1] Shi J, et al. PANDORA-seq expands the repertoire of regulatory small RNAs by overcoming RNA modifications. Nat Cell Biol. 2021 Apr;23(4):424-436.