碧云天生产的活细胞Caspase-3活性与线粒体膜电位检测试剂盒(Caspase-3 Activity and Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit for Live Cell)是基于线粒体膜电位依赖性的深红荧光探针Mito-Tracker Deep Red 633联合Caspase-3酶的荧光底物GreenNuc™ Caspase-3 Substrate检测线粒体膜电位以及凋亡细胞内Caspase-3酶活性的试剂盒。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪或流式细胞仪等荧光检测设备。

Caspase (cysteine-dependent aspartate-specific proteases)的全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，存在于细胞质中，主要利用半胱氨酸(cysteine)侧链选择性地高效切割含有天冬氨酸(aspartate)的多肽底物，在介导细胞凋亡(apoptosis)过程中起重要作用，并参与细胞的炎症、生长和分化等过程。Caspase-3也称CPP32、Yama或apopain，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。Caspase-3是细胞凋亡过程中的一个关键酶，可以直接特异性切割多种底物，包括PARP (poly ADP-ribose polymerase)、ICAD (inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)、proCaspase-6、7和9、gelsolin和fodrin等。这些由Caspase-3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。同时Caspase-3还参与细胞核凋亡过程，如染色质固缩(chromatin condensation)，DNA片段化(DNA fragmentation)等。另外，Caspase-3对凋亡过程中的细胞起泡(cell blebbing)也起到了关键作用。

本试剂盒基于荧光底物GreenNuc™ Caspase-3 Substrate检测Caspase-3酶活性的原理如下。底物GreenNuc™ Caspase-3 Substrate为偶联DNA绿色荧光染料的多肽DEVD，该底物中的DEVD是caspase 3/7的识别序列，并带有大量负电荷。这些负电荷和DNA带有的负电荷相互排斥，使底物中的DNA绿色荧光染料不能结合DNA，也就不能被激发产生绿色荧光。最初没有荧光的底物穿过细胞膜进入细胞质，在凋亡细胞中被Caspase-3/7识别并剪切，释放出活化的DNA绿色荧光染料分子。活化的DNA绿色荧光染料分子迁移进入细胞核，与DNA结合后，形成GreenNuc™-DNA复合物，就可以被激发而产生明亮的绿色荧光。

本试剂盒中Mito-Tracker Deep Red 633，也称MitoTracker™ Deep Red FM检测线粒体膜电位的原理如下。Mito-Tracker Deep Red 633是一种线粒体深红荧光探针，其在线粒体内的积累依赖于线粒体膜电位(与JC-1、TMRE和Rhodamine 123相同)。正常细胞中，Mito-Tracker Deep Red 633对线粒体进行特异性染色，呈明亮的深红荧光；细胞发生凋亡时，线粒体膜电位下降，染料在线粒体内的积累减少，荧光减弱或消失。

本试剂盒通过检测GreenNuc™-DNA复合物的绿色荧光(Ex/Em=500/530nm)和依赖于线粒体膜电位的Mito-Tracker Deep Red 633的深红荧光(Ex/Em=622/648nm)，显示细胞的Caspase-3酶活性以及线粒体膜电位，从而判定细胞凋亡的发生。GreenNuc™-DNA复合物和Mito-Tracker Deep Red 633的激发光谱和发射光谱参考图1。

图1. GreenNuc™-DNA复合物和Mito-Tracker Deep Red 633的激发光谱与发射光谱。

本试剂盒可以实时监测凋亡情况。传统的Caspase活性检测试剂盒，通常需要裂解细胞或组织样品后进行显色或荧光检测；通过Western检测Caspase本身的和剪切后的蛋白表达情况，也只能检测Caspase的表达情况，从一定程度上反映酶活性。基于荧光标记的Caspase抑制剂的检测技术(fluorochrome-labeled inhibitors of caspases, FLICA)可以进入活细胞检测Caspase活性，但其荧光探针本身就是不可逆的Caspase抑制剂，所以无法在活细胞中实时监测Caspase的活力。而本试剂盒中提供的荧光底物GreenNuc™ Caspase-3 Substrate对细胞活性没有明显的抑制作用，不影响Caspase的表达，不抑制细胞的凋亡过程，能实时监测细胞凋亡。

本试剂盒功能强大。使用本试剂盒检测Caspase-3活性的同时，还能够实时监测细胞内线粒膜电位的变化。

本试剂盒使用便捷。本试剂盒中检测试剂配制后直接加入细胞中，孵育20-30分钟后即可直接用于荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪检测等检测系统进行定性或定量检测。使用本试剂盒检测正常细胞、凋亡细胞Caspase-3活性以及线粒体膜电位的效果参考图2。

图2. 活细胞Caspase-3活性与线粒体膜电位检测试剂盒(C1073)检测Caspase-3活性以及线粒体膜电位的效果图。正常培养的BGC-823细胞(人胃癌细胞)在明场下的形态见图A，正常细胞内线粒体被Mito-Tracker Deep Red 633染成洋红色荧光(伪彩色) (图C)。经TS处理3h的BGC-823细胞在明场下的形态见图E。凋亡细胞的细胞核呈绿色荧光(图F)，线粒体呈洋红色荧光(伪彩色) (图G)。TS是由TNFα、SM-164组成的细胞凋亡诱导试剂(C0006S)。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，本图仅供参考。

本试剂盒小包装C1073S和中包装C1073M用于流式细胞仪，每个样品使用200μl的检测工作液，可以分别进行20次和50次检测；用于96孔板每孔检测体系的体积为100μl时可以分别可以检测40次和100次，检测体系体积为200μl时可以分别可以检测20次和50次。实际检测次数会因为检测体系和使用的底物浓度而有所不同。

-20℃保存，一年有效。C1073-1 GreenNuc™ Caspase-3 Substrate和C1073-2 Mito-Tracker Deep Red 633须避光保存。

避免微生物污染，如有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。

染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

GreenNuc™ Caspase-3 Substrate不是很稳定，应尽量避免反复冻融(一般不要超过三次)。

荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。

仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。