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细胞相关> 基因表达调控> 病毒感染
Lenti-CMV-hFcγRIIIa (hCD16a)-F158-IRES-BSD (10^8TU/ml)
产品编号: C4086-100μl
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C4086-100μl Lenti-CMV-hFcγRIIIa (hCD16a)-F158-IRES-BSD (10^8TU/ml) 100μl 621.00元
C4086-500μl Lenti-CMV-hFcγRIIIa (hCD16a)-F158-IRES-BSD (10^8TU/ml) 500μl 2488.00元

Lenti-CMV-hFcγRIIIa (hCD16a)-F158-IRES-BSD (10^8TU/ml),即Lentivirus Expressing Human FcγRIIIa/CD16a with F158 Variant,是碧云天自行研发的一种可以在大多数哺乳动物细胞(包括原代细胞和干细胞)中通过CMV启动子表达人源FcγRIIIa/CD16a-F158蛋白的重组慢病毒。本产品可用于抗体依赖的细胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)的研究,用于抗体药物的研究和开发。本产品带有bsr/BSD/bls抗性基因,感染细胞后可以使用灭瘟素S (Blasticidin S)筛选稳定表达细胞株。

FcγRIIIa/CD16a是一种Fc受体(Fc fragment Receptor, FcR),主要表达于NK细胞、单核细胞和巨噬细胞的表面,属于激活型受体,参与吞噬作用、抗体依赖的细胞毒性作用和免疫复合物的清除。人类的FcγRIIIa/CD16a在氨基酸残基158的位置表现出二态性,其中F158对Fc的亲和力较低,而V158对Fc的亲和力较高[1, 2]。

内部核糖体进入位点序列(Internal Ribosome Entry Site, IRES)是一段茎环结构序列,在上游启动子的控制下IRES连接的两个基因转录成为一条mRNA,在翻译时IRES可以单独招募核糖体,实现IRES上、下游两个不同基因的共表达。通常下游基因的表达要相对弱一些。

慢病毒感染细胞后会将目的基因随机整合到基因组DNA上,因而可以长期稳定地表达目的蛋白,并且几乎可以感染所有哺乳动物细胞,在很多不分裂的细胞中也可以长期稳定表达,广泛应用于细胞和动物实验。

本产品表达bsr/BSD/bls抗性基因,因此本产品感染培养的细胞后可以使用Blasticidin S HCl (灭瘟素S) (ST018)筛选稳定表达的细胞株以用于后续研究。

碧云天的Lenti-CMV-hFcγRIIIa (hCD16a)-F158-IRES-BSD是复制缺陷型慢病毒。其3' LTR的增强子功能发生缺失,形成了自失活(Self-inactivating) 3' LTR,并且5' LRT中的U3区域替换成CMV启动子,在感染普通的细胞后不能进行复制和扩增,从而有效降低了本产品在活体生物中的风险。

碧云天推荐的慢病毒感染不同种类体外培养细胞的MOI值参见下表。

Cell line Tissue Cancer/cell type Species MOI
A431 Epithelial Carcinoma Human 5
A549 Lung Carcinoma Human 5
Astrocytes Nervous system Primary Human 1
B16-F10 Epithelial Melanoma, metastatic Mouse 5
BMM Bone Marrow Primary Human 8
BxPC-3 Pancreas, epithelial Adenocarcinoma Human 10
H3255 Lung Carcinoma, NSCLC Human 10
HCT116 Colon Carcinoma Human 5
HeLa Cervix Carcinoma, epithelioid Human 3
HEK293T Kidney Tumor Human 5
Hepa1-6 Liver Carcinoma Mouse 3
HMVEC Endothelial Endothelial, microvascular Human 100
HT-29 Colon Adenocarcinoma Human 3
HUVEC Umbilicus Endothelial cells Human 100
Jurkat Blood Leukemia, Acute T cell Human 10
LLC-1 Lung Carcinoma Mouse 6
LNCaP Prostate Carcinoma Human 5
MM200 Skin Melanoma Human 5
MCF-7 Breast Adenocarcinoma Human 2
MDA-MB-231 Breast Adenocarcinoma Human 1
MM-AN Skin Melanoma, metastatic Human 16
MMC Breast Carcinoma Mouse 4
MRC-5 Lung, embryonic Fibroblasts Human 1
NB4 Blood Leukemia, acute promyelocytic Human 10
PC12 Adrenal gland Pheochromocytoma Rat 20
SKOV-3 Ovary Adenocarcinoma Human 15
U-2 OS Bone Osteosarcoma Human 5

实验室常用的逆转录病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、腺相关病毒(AAV)和腺病毒(Adenovirus)的主要特征之间的比较和差别参见下表。具体的特定病毒的一些特征和下表相比可能会有一定差异。

Retrovirus Lentivirus AAV Adenovirus
Genome ssRNA(+) ssRNA(+) ssDNA dsDNA
Coat Enveloped Enveloped Naked Naked
Particle size 90-100nm 90-100nm 20-30nm 60-90nm
Genome size 7-10kb 9kb 5kb 38-39kb
Genome integration Yes Yes No No
Packaging capacity 2.5-5kb 2.5-6kb 2.5-4.5kb 3-8kb
Infection tropism Dividing cells Dividing and non-dividing cells Dividing and non-dividing cells Dividing and non-dividing cells
Relative Transduction Efficiency ND 70% 70% 100%
Expression started 48-72h 48-72h 72-96h 24-48h
Expression duration > 2 months > 2 months > 6 months 3-4 weeks
Expression level Medium Medium Medium High
Immune response Low Low Very low High
In vivo safety Medium Medium High Low
Titer before concentration (IFU/ml) 106 107 1011 107
Titer after concentration (IFU/ml) ND 108 0.5-1×1013 1010
Able to obtain high MOI No (≤ 10 copies integrated) No (≤ 10 copies integrated) Yes Yes
Biosafety level BSL-2 BSL-2 BSL-1 BSL-2

本产品的滴度不低于10^8TU/ml,适合细胞实验或活体动物实验。TU, transduction unit,即转导单位。TU通过本产品梯度稀释后感染HEK293T细胞后抽提细胞基因组DNA进行qPCR测定获得,以确定具有生物活性的病毒颗粒数量。MOI (Multiplicity of Infection)是病毒感染细胞时,病毒数量与细胞数量的比值。使用10^8TU/ml的本产品,如果按照5 MOI感染6孔板的细胞,每孔50万细胞计算,每100μl共可以感染4个孔;如果按照5 MOI感染24孔板的细胞,每孔10万细胞计算,每100μl共可以感染20个孔。如果MOI值提高,那么相应可以感染的孔数会减少;如果MOI值下调,那么相应可以感染的孔数会增加。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
C4086-100μl Lenti-CMV-hFcγRIIIa (hCD16a)-F158-IRES-BSD (10^8TU/ml) 100μl
C4086-500μl Lenti-CMV-hFcγRIIIa (hCD16a)-F158-IRES-BSD (10^8TU/ml) 100μl×5
说明书 1份
保存条件:

-80ºC保存,一年有效。-20ºC保存,1-2个月内有效。4ºC保存,一周内有效。

注意事项:

反复冻融会降低病毒滴度,如有必要请在收到本产品后分装保存。分装时必须在冰浴上进行。病毒融解后,如果在一周内使用,可以放置于4ºC,但须注意4ºC存放时间越长,滴度下降越明显。如果-80ºC保存时间超过一年,可能会导致滴度下降,此时建议重新测定病毒滴度。

本产品使用前请仔细阅读附录1《慢病毒使用安全规范》。本产品生物安全等级为Biosafety Level 2 (BSL-2),在按照常规的微生物实验操作要求进行操作(Standard microbiological practices)的基础上,还需要注意限制接触、生物危害提示、显著的警示标识、并制定相应的安全规范。

病毒操作中应注意有效防护,绝对禁止在生物安全柜内有任何皮肤直接暴露的情况。实验完成后,请及时清洗双手。严禁直接接触病毒,如意外接触,请及时用清水冲洗,并适当用70%乙醇对皮肤进行消毒。

任何接触过病毒的材料、试剂、样品,应经消毒处理,可以采用1%的SDS溶液、或84消毒液(1:20)浸泡30分钟以上,或121ºC高压灭菌30分钟。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 感染条件的确定。
MOI (Multiplicity of Infection)定义:病毒感染细胞时,病毒数量与细胞数量的比值。TU (Transduction Units)定义:具有生物活性的病毒颗粒数量。梯度稀释病毒后感染细胞,根据出现荧光的细胞数量或抽提细胞基因组DNA进行qPCR测定来确定具有生物活性的病毒颗粒数量。不同种类的细胞感染所需的MOI值是不同的,如果是初次使用慢病毒感染需要通过实验确定最佳的感染条件。理论上MOI值越高,慢病毒感染可能性越大,感染效率越高,对细胞的毒性也越大。所以预实验的目的是在保证细胞成活率的情况下,确定能够使感染效率达到适宜观察水平的MOI值。
a. 细胞培养(以24孔板HEK293T细胞为例,其它培养板或培养皿参考24孔板进行操作):感染前一天,在24孔板中以约5×104/孔接种HEK293T细胞,每孔加入0.5ml完全培养液,使第二天病毒感染时的细胞密度达到约70-80% (细胞数约1×105)。
注:具体接种数量需根据细胞种类、细胞大小和细胞生长速度等因素而确定。
b. 设置MOI值分别为1、2、5、10、20,计算所需病毒量,计算公式如下:
TU = 感染时的细胞数*×MOI
病毒母液(μl) = TU /滴度(TU/ml)×1000
*一般第二天细胞数按接种细胞数增长1倍来计算,增殖较慢或不增殖的细胞可适当调整。
例如:需要向1×105个HEK293T细胞加入20 MOI的病毒,即所需TU = (1×105 cells)×(20 MOI) = 2×106TU。若病毒母液滴度为1×108TU/ml,则细胞培养液中应加入病毒母液 = 2×106TU / (1×108TU/ml)×1000 = 20μl,即20μl病毒母液。
注:其它细胞株的预实验MOI设置可以参考本说明书中产品简介部分“碧云天推荐的慢病毒感染不同种类体外培养细胞的MOI值”表格或相关文献资料。
c. 按照下图设置MOI预实验组,建议设置复孔以确保实验准确性。尽量减少加入新鲜培养液的量,以提升后续病毒的感染效率。
注1:对于适合使用聚凝胺(Polybrene) (C0351/ST1380)处理的细胞(可以使感染效率提高约2-10倍),弃旧培养液,每孔加入250μl含有6-8μg/ml polybrene的新鲜培养液;
注2:对于不适合使用polybrene处理的细胞(如末端分化的神经元、树突状细胞),弃旧培养液,每孔加入250μl的新鲜培养液。
图1. 细胞感染MOI值预实验设计分组。MOI依次设置为:1、2、5、10、20。并同时设置加含6-8μg/ml polybrene的培养液实验组,不含polybrene的培养液实验组及Blank组(空白对照组)。Blank组可作为参照,以检验细胞生长状态。本图中实验设置仅供参考,用户应根据实际情况自行适当调整。
d. 取出本产品置于冰上解冻,混匀后,将根据特定MOI值计算好的病毒母液量分别加入细胞培养板中,轻轻混匀后继续培养。
注:如果病毒滴度太高,需加的病毒母液量较少或多孔板如96孔板和48孔板等培养液体积比较小的情况,可以先将病毒母液用培养液进行适当稀释后再加入。
e. 感染后约4小时,每孔补加250μl新鲜培养液。
f. 感染后约24小时,进行换液。弃含病毒的培养液,每孔加入新鲜的完全培养液,继续培养。
注:换液的具体时间需视细胞状态而定,如果慢病毒对细胞有明显毒性作用,影响细胞生长状态,最短可于加病毒4小时后更换新鲜培养液。
g. 继续培养约48-96小时后观察细胞生长状况及荧光蛋白表达情况,以不显著影响细胞生长、荧光较强且感染效率便于荧光观察的MOI值和感染后时间为最佳条件。
h. 如果有必要,可以根据特定细胞加入适当浓度的Blasticidin S HCl (灭瘟素S) (ST018),以筛选被感染的细胞,后续可以通过稀释法等获取单克隆细胞株。灭瘟素S的浓度可以通过梯度稀释的预实验来确定,以刚好能完全杀死目的细胞的浓度为宜。
注1:细胞并非感染效率越高越好,通常约20-70%的感染效率已经足以进行后续检测,感染效率过高反而容易产生细胞毒性而干扰检测。
注2:通常在慢病毒感染细胞后72小时即可观察到荧光蛋白表达的出现,在96小时左右有较强的表达效果。
注3:对于感染慢病毒后出现较强细胞毒性的情况,可以尝试在感染后4小时更换成新鲜的完全培养液。
2. 感染细胞和验证。
按照步骤1获得的条件进行病毒感染实验,可以在慢病毒感染细胞后48-96小时后,或者在筛选获得CMV-hFcγRIIIa (hCD16a)-F158-IRES-BSD的稳定表达细胞株后,采用合适的抗体对人源的FcγRIIIa/CD16a的表达情况进行Western blot或流式细胞仪检测。
附录:
1. 慢病毒使用安全规范。
a. 作为一种相对安全的病毒,尽管慢病毒在正常细胞内不能进行复制和扩增,但是慢病毒基因组可以整合到被感染细胞的基因组中,因此仍然具有可能的潜在生物学危险。我们建议使用者在病毒操作前应仔细阅读本规范,并在实验中严格按照本规范的要求进行操作。更为严格的美国CDC的生物安全等级及其操作与防护要求参考附表1,也可以访问如下网页:https://www.cdc.gov/labs/bmbl/index.html。
b. 慢病毒操作时应使用相应级别的生物安全柜,不同的慢病毒的生物安全等级会有所不同。如果使用普通超净工作台操作病毒,请不要打开排风机,以尽量避免可能污染病毒的尘埃正面吹向操作人员而被吸入。
c. 实验操作时必需佩戴一次性帽子、口罩,穿戴实验手套及专门的实验服,避免身体直接接触病毒。手部及面部有开放性创口时,禁止进行病毒操作。
d. 操作病毒时需小心谨慎,不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台或其它器皿上有病毒污染,请立即用70%乙醇或2% SDS溶液擦拭干净,或者采取其它的妥善措施。
e. 如果需要离心,应使用密封性好的离心管,或用封口膜密封后离心,最好使用专门的离心机。
f. 用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤:拧紧培养瓶或盖紧培养板,用70%乙醇清理培养瓶或培养板外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前,用70%乙醇擦洗显微镜实验台。
g. 所有被病毒污染过的枪头、离心管、培养板(皿、瓶)、培养液、手套等,在丢弃前请用84消毒液或2% SDS浸泡过夜。
h. 脱掉手套后,用肥皂或洗手液清洗双手。
i. 病毒飞溅或是含有病毒的气溶胶与人体接触,须用大量清水冲洗眼睛、皮肤或粘膜等接触的部位至少15min。
j. 含病毒的针头或是其它利器刺破皮肤,伤口应立即用10%的碘伏溶液擦洗数分钟,然后用大量清水冲洗。
k. 装盛慢病毒的实验用品需单独放置,并须加以适当标示。
l. 对同实验室的人员须进行慢病毒安全培训或安全警示。
2. 生物安全等级及其操作与防护要求。
Summary of Recommended Biosafety Levels for Infectious Agents
BSL Agents Practices Primary Barriers and Safety Equipment Facilities
(Secondary Barriers)
1 Not known to consistently cause diseases in healthy adults Standard microbiological practices ■ No primary barriers required.
■ PPE: laboratory coats and gloves; eye, face protection, as needed
Laboratory bench and sink required
2 ■ Agents associated with human disease
■ Routes of transmission include percutaneous injury, ingestion, mucous membrane exposure
BSL-1 practice plus:
■ Limited access
■ Biohazard warning signs
■ “Sharps” precautions
■ Biosafety manual defining any needed waste decontamination or medical surveillance policies
Primary barriers:
■ BSCs or other physical containment devices used for all manipulations of agents that cause splashes or aerosols of infectious materials
■ PPE: Laboratory coats, gloves, face and eye protection, as needed
BSL-1 plus:
■ Autoclave available
3 Indigenous or exotic agents that may cause serious or potentially lethal disease through the inhalation route of exposure BSL-2 practice plus:
■ Controlled access
■ Decontamination of all waste
■ Decontamination of laboratory clothing before laundering
Primary barriers:
■ BSCs or other physical containment devices used for all open manipulations of agents
■ PPE: Protective laboratory clothing, gloves, face, eye and respiratory protection, as needed
BSL-2 plus:
■ Physical separation from access corridors
■ Self-closing, double-door access
■ Exhausted air not recirculated
■ Negative airflow into laboratory
■ Entry through airlock or anteroom
■ Hand washing sink near laboratory exit
4 ■ Dangerous/exotic agents which post high individual risk of aerosol-transmitted laboratory infections that are frequently fatal, for which there are no vaccines or treatments
■ Agents with a close or identical antigenic relationship to an agent requiring BSL-4 until data are available to redesignate the level
■ Related agents with unknown risk of transmission
BSL-3 practices plus:
■ Clothing change before entering
■ Shower on exit
■ All material decontaminated on exit from facility
Primary barriers:
■ All procedures conducted in Class III BSCs or Class I or II BSCs in combination with full-body, air-supplied, positive pressure suit
BSL-3 plus:
■ Separate building or isolated zone
■ Dedicated supply and exhaust, vacuum, and decontamination systems
■ Other requirements outlined in the text
BSL, biosafety level; PPE, personal protective equipment.
参考文献:
1. Coënon L, Villalba M. Front Immunol. 2022. 13:913215.
2. Kremer PG, Barb AW. J Biol Chem. 2022. 298(9):102329.
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