使用说明：
1.类器官完全培养液的配制。
a.将类器官培养液添加剂A和B从-20ºC取出，置于冰上或4ºC进行解冻。
b.按照类器官基础培养液:添加剂A:添加剂B=100:2:1的比例配制类器官完全培养液。例如配制100ml类器官完全培养液，取2ml添加剂A和1ml添加剂B加入100ml类器官基础培养液中，混匀即得约100ml类器官完全培养液。
注：配制好的类器官完全培养液可适当分装后，置于4ºC保存，6个月内有效。
2.从组织样本建立类器官。
a.采集相应组织样本，并按照BeyoOrganoid™组织保存液(C5521) (推荐用于消化道组织以外的各种手术组织样本)或BeyoOrganoid™消化道组织保存液(C5523) (推荐用于哺乳动物消化道手术组织样本)的使用说明对组织进行洗涤和保存。
b.转移/运输样本。
注：转移/运输样本的过程中需将温度严格控制在2-8ºC，并尽量缩短运输时间。
c.类器官建模前检查所获得的组织样本是否完全由上皮类组织组成，如掺杂脂肪或肌肉组织，请尽可能多地去除这些非上皮组分。
d.PBS (C0221A)洗涤组织2次。
e.在培养皿中，使用手术剪刀或手术刀将组织处理为<1mm³的组织块，并将组织块转移至15ml无菌离心管(FTUB515)中。
f.向离心管中加入10ml BeyoOrganoid™组织消化液(C5501)，置于37ºC消化0.5-1小时。期间需严格监控消化过程，每隔15分钟使用10ml移液管上下吹打混匀10-20次，当大多数组织块可以顺利通过1ml吸头时，则组织消化完成。
注：组织消化时间因样本而异，对于消化困难的样本可适当延长孵育时间至1.5小时。
g.当达到组织消化终点时，向组织消化液中加入0.5ml FBS进行终止，即终止时FBS的浓度为5%。
h.终止消化后，使用70-100μm细胞过滤器对组织消化液进行过滤。推荐使用碧云天BeyoGold™细胞过滤器(70μm孔径, 无菌) (FSTR070/FSTR072)或BeyoGold™细胞过滤器(100μm孔径, 无菌) (FSTR100/FSTR102)。
i.将过滤后的细胞以300×g室温离心3分钟。如见红色沉淀物，则去除上清，加入2ml红细胞裂解液(C3702)在室温下孵育3-5分钟裂解红细胞。然后以300×g再次室温离心3分钟。
j.去除上清，用5ml类器官基础培养液重悬细胞，300×g室温离心3分钟，再重复本步骤1次。
k.弃上清，用基质胶重悬细胞沉淀，为防止基质胶凝固，应保持冰上操作。使用基质胶量取决于细胞沉淀的多少，大约每1万个细胞使用25μl的基质胶进行重悬。推荐使用碧云天Matrix-Gel™基质胶(类器官用, 不含酚红) (C0396)和BeyoGold™系列超低吸附培养孔板(FULA035-FULA985)，以下以24孔板(FULA243/FULA245)为例。
注：基质胶的比例通常大于70%，否则可能会抑制基质胶固化液滴的形成。
l.取出提前在培养箱中预热的24孔板，使用已预冷的200μl吸头，立即将重悬后的细胞基质胶复合物滴加到预热的24孔板中，每个孔约30μl，滴于孔中心，并立即置于培养箱中孵育10-30分钟以固化基质胶。
注：避免细胞基质胶复合物接触培养板侧壁，以免基质胶在移液过程中凝结。
m.待基质胶凝固后，向24孔板中加入500µl类器官完全培养液，置于培养箱中培养，并每隔3-4天更换为新鲜、预热的完全培养液。 注：类器官完全培养液加入时不要直接加于基质胶悬滴上。
n.显微镜下观察类器官的生长状态，理想状态下，类器官细胞7-14天左右即可进行传代。碧云天同时提供Beyo3D™系列的类器官或3D细胞的检测试剂盒(C1341-C1455)。
3.类器官的传代和扩增。
注：可参考步骤3a-3e进行操作将类器官细胞从基质胶中释放出来，但更推荐使用BeyoOrganoid™类器官分离回收液(C5519)，可在不破坏类器官三维结构和生理功能的前提下，温和而快速地从基质胶中分离出类器官。
a.小心去除类器官完全培养液上清。
注：避开类器官基质胶悬滴，吸取时注意不要将悬滴吸起。
b.使用200μl移液器轻缓吹吸，破坏类器官基质胶悬滴，并将类器官基质胶悬浮液转移至15ml无菌离心管中。
c.将各孔类器官基质胶悬滴均转移至15ml离心管后，向原培养板每孔中加入少量类器官基础培养液(例如24孔板每孔125μl，6孔板每孔250μl)，将残留的类器官基质胶转移至相应的15ml无菌离心管中。
d.使用5ml移液管将类器官/基质胶/类器官完全培养液混合物上下移液吹吸20-30次，以完全破坏基质胶结构。在这一步骤中，充分机械破坏基质胶结构，将类器官细胞从基质胶中释放出来非常关键。
e.300×g室温离心3分钟，去除上清，加入5ml PBS，吹吸混匀，300×g室温离心3分钟。
f.去除上清，将沉淀物重悬于1-2ml的BeyoOrganoid™类器官传代消化液(C5503)或BeyoOrganoid™类器官传代温和消化液(C5513)中，上下吹吸数次，置37ºC孵育，直到类器官细胞团打散。类器官消化过程中，每2-3分钟使用移液管上下移液吹吸5-10次，并在显微镜下密切观察消化过程，严格把握类器官消化时间。
注1：通常来说，消化至单细胞或寡细胞团(由10-30个细胞组成)，则消化过程完成。
注2：某些类器官模型不应被完全消化成单个细胞，否则它们传代后的类器官结构形成能力将受损。如果有可用的类器官模型特定信息，请参考该信息。
注3：对某些类器官模型而言，消化过长时间(>15分钟)可能会导致类器官细胞传代后生长不良甚至停止生长。
g.类器官消化到达终点后，加入5ml类器官基础培养液，吹吸混匀，300×g室温离心3分钟。
h.去除上清，将类器官沉淀物重悬于基质胶中，并按照步骤2k-2n的描述进行传代培养。
4.类器官的冻存。
a.将待冻存的类器官细胞按实验步骤3a-3g从类器官基质胶悬滴中收集类器官并去除基质胶。
b.如果从多孔收获并冻存类器官，则将步骤3h的多个生长状态类似的类器官沉淀加入类器官基础培养液重悬后集中到一个15ml离心管中，轻轻吹打混匀，300×g室温离心3分钟。
c.每1×10⁶个活细胞或每100-200μl类器官/基质胶悬滴，用0.5-1ml BeyoOrganoid™类器官细胞冻存液(C5517)重悬沉淀。
d.使用移液管将类器官重悬液按每管0.5-1ml分装至细胞冻存管(FCV011/FCV016/FCV021/FCV028)中。推荐LAB MARKER (耐酒精记号笔, 0.4/1.0mm) (FPP21/FPP23/FPP25)进行标记，特别适合细胞复苏时使用70-75%乙醇对冻存管表面进行消毒。
e.将冻存管转移至细胞冻存盒中进行程序降温后转移至液氮罐中长期保存。类器官冻存时，程序降温速度以1ºC/分钟为宜，推荐使用具有降温速度为1ºC/分钟的BeyoCool™细胞冻存盒(FCFC012/FCFC015/FCFC021)系列产品进行程序性降温冻存，并在-80ºC放置至少24小时后转移至液氮中保存。
5.类器官的复苏。
a.将冻存管在37ºC水浴锅中迅速完全融化(保持冻存管的盖子在液面以上以防止污染)，并适当轻轻摇晃促融，切勿vortex。快速、完全融化可以提高细胞的复苏效果。
b.打开冻存管前时用70%酒精擦拭细胞冻存管外壁，注意某些记号笔不耐酒精，小心标注的记号被擦拭掉。推荐LAB MARKER (耐酒精记号笔, 0.4/1.0mm) (FPP21/FPP23/FPP25)进行标记，特别适合细胞复苏时使用70-75%乙醇对冻存管表面进行消毒。
c.将完全融化的细胞溶液转移至含有预热的10ml类器官基础培养液的15ml无菌离心管中，并额外使用1ml类器官基础培养液冲洗冻存管，合并冲洗液至15ml离心管中。
d.300×g室温离心3分钟，吸除上清，注意不要吸走类器官细胞沉淀。
注1：离心管应置于冰上操作。
注2：如果在冻存时基质胶没有去除彻底，则在离心后可能存在一层混浊的基质胶。如果显微镜下没有观察到基质胶层中有大量的类器官细胞，应将基质胶层去除。反之，如果基质胶层中观察到类器官细胞，则需进行额外的清洗。额外的清洗步骤为加入10ml类器官基础培养液，吹吸混匀，然后重复步骤5d。
e.将细胞沉淀使用基质胶重悬，参照步骤2k-2n进行类器官培养，或根据后续实验需求，加入适量预热的对应类器官完全培养液重悬细胞，轻轻吹匀后转移至培养器皿中，放入细胞培养箱中培养。
参考文献：
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