使用说明：
1.从动物组织中提取总DNA。
a.取不超过25mg的组织(脾不超过10mg)，尽量在10mg左右，剪切成尽可能小的碎片，加入180µl样品裂解液A。或置于液氮中研磨成粉末，再加入180µl裂解液A。也可将组织置于1.5ml离心管中，加入180µl冰浴预冷的裂解液A，用微型电动匀浆器匀浆(如E6600)，或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。
请勿使用过多的样品，过多的样品会导致抽提效果下降。较小的组织碎片会使裂解速度加快，裂解效果提高。新鲜或冻存的组织均可，但固定过的组织请参考后续的其它步骤进行。
b.加入20µl蛋白酶K，Vortex混匀，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。裂解的时间因组织不同而有所不同，通常可在1-3小时内完成。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。
c.清除RNA (可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4µl 100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置2分钟。
转录活性水平很高的组织例如肝和肾组织，RNA含量很高，在不做清除RNA的操作步骤(步骤1.c)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有小部分RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤1.d。
d.最高速剧烈Vortex 15秒。加入200µl样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
加入样品裂解液B后需立即Vortex混匀。加入样品裂解液B后可能会产生白色沉淀，但大多数情况在70℃孵育后会溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不会干扰后续实验。有些组织例如肺、脾，在加入样品裂解液B后可能会形成凝胶状物，此时需剧烈晃动或Vortex样品，以尽量破坏凝胶状物。
e.加入200µl无水乙醇，Vortex混匀。
加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部用于和磁珠的结合，沉淀不会影响抽提效果。
f.向步骤e中的混合物加入20µl BeyoMag™磁珠悬液(使用前务必混匀)，轻柔混匀后，室温放置3-5分钟。将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸除残液。
磁珠在使用前一定要涡旋或震荡混匀。如有必要，可适当增加磁珠用量，延长结合时间以提高得率。
g.加入500µl洗涤液Ⅰ，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
h.加入600µl洗涤液Ⅱ，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
i.将离心管室温放置5-10分钟，或置于37℃鼓风烘箱5分钟，确保残留的乙醇等微量液体完全挥发。
j.加入50-100μl洗脱液，轻柔震荡使磁珠悬于溶液中，室温孵育3-5分钟，其间甩动离心管1-2次。将离心管置于磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸取溶液至新离心管中，置于-20℃保存。所得溶液即为纯化的总DNA。
如需获得更高浓度的样品，可把洗脱液的体积减小至20µl，但洗脱下来的DNA量会相对减少。室温较低时，洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原磁珠再洗脱一次，可提高得率约10-30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量15-40%的DNA。
2.从鼠尾中抽提总DNA。
a.取0.4-0.6cm的大鼠尾尖一段，或小鼠尾尖最多两段，加入180µl样品裂解液A。
小鼠尾尖最长不能超过1.2cm，大鼠尾尖不能超过0.6cm。如果使用的是成年大鼠或小鼠，建议仅使用0.4-0.6cm长的尾尖。如果抽提鼠尾的DNA用于基因型鉴定(Genotyping)，使用0.2-0.3cm长的尾尖已经足够。
b.加入20µl蛋白酶K，Vortex混匀，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。并确保鼠尾浸没在裂解液内。裂解完全通常需6-8小时。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。
c.清除RNA (可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，则加入4µl 100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置2分钟。
鼠尾中RNA含量很低，但在不做清除RNA的操作步骤(步骤2.c)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有少量的RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤2.d。
d.按照等体积混合适当体积的样品裂解液B和无水乙醇，Vortex混匀。
每一个样品，需混合200µl样品裂解液B和200µl无水乙醇。如果有10个样品，则需混合2ml样品裂解液B和2ml无水乙醇，以此类推。配制好的样品裂解液B和无水乙醇的等体积混合液，室温放置，3个月内有效。必须Vortex充分混匀，否则会严重影响抽提效果。
e.最高速剧烈Vortex 15秒。加入400µl步骤d配制的样品裂解液B和无水乙醇等体积混合液，剧烈Vortex混匀。
加入样品裂解液B和无水乙醇的等体积混合液后可能会产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部用于和磁珠的结合，沉淀不会影响抽提效果。
f.转步骤1.f，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.f起的步骤。
3.从培养的动物细胞中抽提总DNA。
a.收集最多不超过500万的细胞，离心沉淀后重悬于200µl PBS (C0221A)中。
PBS需自备。如果使用冻存的细胞沉淀，先把细胞沉淀解冻，并轻轻弹散，然后再加入PBS。对于基因组DNA含量较高的细胞，例如HeLa细胞，应使用较少的细胞，例如100-200万HeLa细胞。
b.清除RNA (可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4µl 100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置2分钟。
在不做清除RNA的操作步骤(步骤3.b)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有小部分RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤3.c。
c.加入20µl蛋白酶K，Vortex混匀。
d.加入200µl样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合。
e.加入200µl无水乙醇，Vortex混匀。
加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能会产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部用于和磁珠的结合，沉淀不会影响抽提效果。
f.转步骤1.f，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.f起的步骤。
4.从动物血液中抽提总DNA。
本操作方法也适用于血沉棕黄层(Buffy coat)和骨髓(Bone marrow)的总DNA抽提。
a.取50-100µl红细胞无细胞核的血，或5-10µl红细胞有细胞核的血。
人、猴、牛、兔、大鼠、小鼠等的红细胞无细胞核，鸟、鱼、蛙等的红细胞有细胞核。红细胞有细胞核会导致相同体积的血液内DNA的含量非常高。
b.加入20µl蛋白酶K。
c.加入PBS至总体积为220µl，Vortex混匀。
d.加入200µl样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
e.转步骤3.e，后续步骤同“从培养的动物细胞中抽提总DNA”3.e起的步骤。
5.从石蜡包埋的组织样品中抽提总DNA。
由于包埋的组织通常已经被固定，通常仅能获得长度小于650bp的DNA。乙醇或甲醛固定的石蜡包埋组织样品相对比较适合DNA的抽提，而有交联作用的固定试剂(例如锇酸)固定的组织则不适合用于抽提DNA。需自备二甲苯。
a.取一块小于25mg的包埋块，加入1.2ml二甲苯，剧烈Vortex，以充分脱腊。
b.台式离心机最高速(12,000-14,000rpm)室温离心5分钟，弃上清。
注：去除上清的时候要非常小心，不要把沉淀丢失了。
c.加入1.2ml无水乙醇，轻轻Vortex混匀，以去除残留的二甲苯。
d.台式离心机最高速(12,000-14,000rpm)室温离心5分钟，弃上清。
注：去除上清的时候要非常小心，不要把沉淀丢失了。
e.重复步骤c和d一次，即再用乙醇洗涤样品一次。
f.弃上清后再最高速离心1分钟，用20µl枪小心吸除残留的液体。
g.室温放置数分钟至乙醇全部挥发。
h.加入180µl样品裂解液A。
i.转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
6.从甲醛固定的组织中抽提总DNA。
由于组织已经被固定，通常仅能获得长度小于650bp的DNA。甲醛或乙醇固定的组织样品相对比较适合DNA的抽提，而有交联作用的固定试剂(例如锇酸)固定的组织则不适合用于抽提DNA。乙醇固定的组织可以参考甲醛固定的组织的抽提方法进行总DNA的抽提。
a.取不超过25mg的组织，用PBS洗涤两次，以充分去除固定液。
b.去除PBS，转步骤1.a，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.a起的步骤。
7.从革兰氏阴性菌中抽提总DNA。
a.离心收集最多不超过20亿个细菌，弃上清。
b.加入180µl样品裂解液A，充分重悬细菌。
c.转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
8.从革兰氏阳性菌中抽提总DNA。
需自备溶菌酶，并配制溶菌酶溶液：20mM Tris, pH8.0, 2mM EDTA, 1.2% Triton X-100, 20mg/ml溶菌酶。溶菌酶在临使用前加入。
a.离心收集最多不超过20亿个细菌，弃上清。
b.用180µl溶菌酶溶液充分重悬细菌。
c.37℃孵育30分钟以裂解细菌。
d.加入20µl蛋白酶K，Vortex混匀。
e.加入200µl样品裂解液B，Vortex混匀。
注：不可把蛋白酶K直接加入到样品裂解液B中。
f.70℃孵育30分钟。
g.转步骤1.e，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.e起的步骤。
9.从酵母中抽提总DNA。
需自备用于裂解酵母的酶Lyticase，并配制酵母裂解液：1M 山梨糖醇(Sorbitol)，100mM EDTA，14mM 2-巯基乙醇。
a.离心收集最多不超过50万个酵母，弃上清。
b.用600µl上述酵母裂解液重悬，加入200U Lyticase，30℃孵育30分钟。
注：裂解的时间会随酵母的种类不同而有所不同，详细情况请参考Lyticase的说明书。
c.300×g离心10分钟收集沉淀，弃上清。
d.沉淀用180µl样品裂解液A重悬。
e.转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
10.从昆虫中抽提总DNA。
a.用液氮冷冻后研碎处理：
a)取最多不超过50mg昆虫(例如果蝇)，液氮冷冻后研碎，转移至1.5ml离心管中。
b)加入180µl样品裂解液A。
c)转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
b.用匀浆器匀浆处理：
a)取最多不超过50mg昆虫(例如果蝇)。
b)加入180µl PBS，用电动匀浆器或玻璃匀浆器匀浆。
c)转步骤3.b，后续步骤同“从培养的动物细胞中抽提总DNA”3.b起的步骤。
11.从其它样品中抽提总DNA。
对于某些样品需使用特定的裂解液裂解，可以参考如下方法进行总DNA的抽提。
a.样品用200µl特定的裂解液裂解。裂解需确保呈溶液状态，如果有不溶物需通过离心沉淀去除。
b.加入20µl蛋白酶K。
c.加入200µl样品裂解液B，立即Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
注：检查整个溶液的pH值，确保pH值小于7.0，否则DNA结合到磁珠的效率会很低。
d.转步骤1.e，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.e起的步骤。
参考文献：
1.Vogelstein B, Gillespie D. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979. 76(2):615-9.
2.Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, et al. J Clin Microbiol. 1990. 28(3):495-503.
3.Archer MJ, Lin B, Wang Z, Stenger DA. Anal Biochem. 2006. 355(2):285-97.
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