Cas9 HF-NLS (SpCas9 HF-NLS)，即含有核定位信号的CRISPR-associated endonuclease Cas9 (也称Csn1)的Cas9 NLS 核酸酶的高保真突变体，是碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种来源于Streptococcus pyogenes，能在gRNA引导下序列特异性地切割双链DNA的核酸内切酶。本产品可显著减少DNA的非特异性切割，可以用于细胞内的CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑，也可以用于体外筛选高效的guide RNA (gRNA)序列、特定DNA序列在gRNA引导下的剪切、含有特定序列的双链环形DNA的线性化等用途。

Cas9 HF-NLS是指含有4个突变位点(N497A/R661A/Q695A/Q926A)的Cas9 NLS蛋白高保真突变体[1]；其N端和C端都含有SV40 T抗原的核定位序列(Nuclear localization signal or nuclear localization sequence, NLS)，使Cas9与gRNA形成的复合物在转染进入细胞后、能迅速地从细胞质进入到细胞核内，从而大大地提高了基因编辑的效率。Cas9 HF-NLS可以通过显微注射、电穿孔和脂质体介导等方法进入细胞，而这种不需要使用DNA的系统不会产生外源DNA整合至细胞基因组的风险[2]。

CRISPR/Cas9是一项突破性的基因组编辑技术，操作便捷，应用广泛。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一种原核生物利用RNA引导的DNA核酸酶Cas9对外源的噬菌体或病毒核酸进行基因沉默的获得性免疫系统(adaptive immune system)，后续在此基础上逐渐发展为广泛应用于原核和真核生物的越来越成熟的基因编辑技术。该技术能够在gRNA引导下通过Cas9对原核和真核生物的基因组DNA的靶向序列进行位点特异性的切割，然后通过易错修复(error-prone repair)或同源重组(homologous recombination)在切割位点改变或插入序列来产生移码突变，从而通过基因编辑而实现基因敲除。其中gRNA确保识别位点的特异性。随着CRISPR技术的发展，该技术目前不仅可以实现基因敲除，还可以实现基因的点突变、插入突变等多种突变方式，特别是在临床应用方面可以用于修复不良突变等[3, 4]。同时通过构建没有内切酶活性的Cas9突变体dCas9，通过与dCas9直接融合表达或间接招募转录激活或转录抑制因子，可以实现sgRNA靶向基因的转录激活或转录抑制。

CRISPR/Cas9系统由Cas9 Nuclease和gRNA复合物所组成。gRNA，也称sgRNA (single guide RNA)，由18-20bp与靶基因序列互补的CRISPR RNA (crRNA)序列以及能与Cas9特异性结合的trans-activating crRNA (tracrRNA)序列组成。gRNA通过与靶序列之间的互补配对，将Cas9 Nuclease引导至靶DNA，Cas9 Nuclease C端的与PAM (proto-spacer adjacent motif)相互作用的结构域(PAM-interacting domain)识别富含G碱基(5' -NGG-3')的PAM序列，在HNH和RuvC两个结构域的协同作用下，在PAM序列NGG上游大约三个碱基处产生DNA的双链断裂(Double-strand break, DSB)。如果该双链DNA断裂发生在细胞内，在细胞DNA修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换，从而可能产生移码突变，导致目的基因的缺失突变(图1) [3]。

图1. 碧云天Cas9 HF-NLS基因编辑示意图。

碧云天生产的Cas9 HF-NLS体外酶活检测效果请参考图2。

图2. 碧云天生产的Cas9 HF-NLS (SpCas9 HF-NLS) (D0518)体外酶活检测的效果图。反应体系：20μl水(DNase/RNase-Free)、3μl Cas9 HF-NLS Reaction Buffer (10X)、3μl 300nM gRNA (Target sequence：5' -GGTTAATGTCATGATAATAA-3' )、1μl Cas9 HF-NLS (分别为0.0625、0.5、1.0pmol)，25ºC预孵育10分钟。然后加入3μl 30nM的pUCm-T (D2006)线性化质粒，37ºC孵育15分钟；然后加入1μl蛋白酶K (Proteinase K, ST533)，室温孵育10分钟以终止反应；最后加入6μl DNA上样缓冲液(6X) (D0071)，进行电泳检测。gRNA与Cas9 HF-NLS结合后，引导后者至pUCm-T与gRNA互补的序列酶切产生2206bp和567bp的片段。如图2所示，本产品与N公司(Competitor)的Cas9 HF-NLS具有相当的酶活性。实际效果会因样品种类、检测条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。

来源：通过E.coli重组、表达、纯化而获得，表达基因来源于Streptococcus pyogenes。

用途：细胞基因编辑、体外筛选高效gRNA序列、特定双链DNA在gRNA引导下的剪切、含有特定序列双链DNA的选择性线性化等。

纯度：不含DNA外切酶，不含非gRNA依赖的DNA内切酶，不含RNA酶。

浓度：20μM (~3.2μg/μl)。

酶储存溶液：10mM Tris, 300mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% (v/v) Glycerol, pH7.4 @ 25ºC。

Cas9 HF-NLS Reaction Buffer (10X): 500mM Tris-HCl, 1M NaCl, 100mM MgCl₂, 1mg/ml BSA, pH7.9 @ 25ºC。

-20ºC保存，至少一年有效。-80ºC可以保存更长时间，尽量避免反复冻融。

本产品使用时会涉及gRNA和DNA的操作，必须注意RNase-free和DNase-free的相关操作。所有自行准备的试剂和耗材也都应是Nuclease-free的。如果可能有核酸酶污染，可考虑用0.01%的DEPC处理过夜，然后高温高压处理后使用。操作时建议戴一次性口罩操作。

对于操作环境中核酸酶的去除，推荐使用碧云天生产的RNase and DNase Away (R0123)以去除实验桌、仪器设备等表面或其它接触面上的核酸酶。反应体系中推荐加入RNase Inhibitor以保护RNA不被降解。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。