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| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 产品价格 |
| D3039-1μg | pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒) | 1μg | 888.00元 |
| D3039-100μg | pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒) | 100μg | 1169.00元 |
pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中融合表达λN肽段、核外运信号和生物素连接酶(miniTurbo)的以用于生物素标记与RNA诱饵片段相互作用的目的蛋白的质粒。RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)是在活细胞内(in Vivo)以RNA为中心(RNA-centric)，利用生物素连接酶对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记，后续通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱(Mass spectrometry, MS)或Western鉴定RNA-蛋白质间相互作用的技术(图1)。RaPID在筛选和鉴定活细胞内非编码RNA序列(Noncoding RNA sequence)：包括长链非编码RNA (Long noncoding RNA, lncRNA)、小核仁RNA (Small nucleolar RNA, snoRNA)和非翻译mRNA区域(Untranslated mRNA region)，与RNA结合蛋白(RNA-binding protein, RBP)相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用[1-3]。
图1. 碧云天RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)生物素标记质粒的工作原理图。
RaPID具有如下优点：①活细胞内标记：适合空间和时间上对细胞内RNA-蛋白质间的相互作用动态过程的研究，如亚细胞定位、翻译后修饰或蛋白质浓度变化导致的影响，还可以提供动力学数据。②不需要交联：RaPID无需交联，传统的甲醛或紫外光照射交联不仅对细胞影响较大，而且交联效率较低。③敏感性高：RaPID可以有效识别RNA与蛋白之间微弱、短暂的相互作用。④所需细胞数目少：相比于常见的ChIRP (Chromatin Isolation by RNA Purification)技术需要1-5×108个细胞，RaPID只需要2-5×106个细胞。⑤适用RNA种类多：对RNA结构没有限定，具有二级结构和无特定结构均可，而且可以研究<50nt的小RNA片段。⑥反应速度快：加入生物素后，miniTurbo最快10分钟就可以完成对RNA结合蛋白的生物素标记。
RaPID包括2个质粒：RaPID生物素连接酶载体(pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag) (本产品)，即RaPID protein；和RNA诱饵载体(pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB) (D3040)，即RNA component。
pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒)可在哺乳动物细胞中融合表达λN肽段、核外运信号和生物素连接酶(miniTurbo)：λN肽段(MNARTRRRERRAEKQAQWKAAN, 22aa)能够将miniTurbo定位结合到RNA诱饵片段旁的BoxB茎环结构上；核外运信号(Nuclear Export Signal, NES) 辅助miniTurbo进入细胞质中；miniTurbo是利用酵母表面展示(Yeast surface display)基于E.coli生物素连接酶(BirA)人工改造获得的新型生物素连接酶，在ATP存在的条件下，miniTurbo可以高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5'腺苷酸(Biotinoyl-5'-AMP)，对与其邻近的(~10nm)任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记，从而对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记。
pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (D3040)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中表达RNA诱饵片段的载体，RNA诱饵片段被2个λ噬菌体(Bacteriophage lambda)的BoxB RNA茎环结构夹在中间，其中BoxB茎环结构与λN肽段具有极高的亲和力。
本质粒含有CMV启动子，可以高效启动λN-NES-miniTurbo-Flag在细胞中的表达；表达的融合蛋白带有3X Flag标签便于检测；带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和新霉素(Neomycin)抗性，可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌；转染哺乳动物细胞后，可使用G418 (ST081)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株，G418和新霉素效果一致，但G418的细胞毒性更低。
pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag质粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| CMV promoter | 235-818 |
| λN peptide | 907-972 |
| linker | 973-1005 |
| NES,Nuclear Export Signal | 1015-1041 |
| miniTurbo | 1048-1818 |
| 3X Flag Tag | 1825-1890 |
| BGH poly(A) signal | 1925-2149 |
| f1 ori | 2195-2623 |
| SV40 promoter | 2637-2966 |
| Neomycin resistance gene | 3033-3827 |
| SV40 poly(A) signal | 4001-4122 |
| lac operator | 4195-4211 |
| CAP binding site | 4264-4285 |
| ori | 4573-5158 |
| Ampicillin resistance gene | 5329-6189 |
| Ampicillin promoter | 6190-6294 |
pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag质粒(6325bp)的图谱如下：
pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag表达基因的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D3039 pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒).pdf。
pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag中没有的酶切位点包括：
| AarI | AbsI | AccIII | Acc65I | AcvI | AfeI | AflII |
| AgeI | AjuI | AleI | Aor13HI | Aor51HI | AscI | AsiGI |
| AsiSI | Asp718I | AxyI | BaeI | BarI | BbrPI | BfrI |
| BlpI | BoxI | Bpu1102I | Bse21I | BseAI | BsgI | BshTI |
| BsiWI | BsmBI | Bsp13I | Bsp1407I | Bsp1720I | BspEI | BspTI |
| BsrGI | Bst98I | BstAFI | BstAUI | BstEII | BstHPI | BstPI |
| BstPAI | Bsu36I | CelII | Cfr42I | CspAI | Eco32I | Eco47III |
| Eco72I | Eco81I | Eco91I | EcoO65I | EcoRI | EcoRV | Esp3I |
| FseI | FspAI | HindIII | HpaI | I-CeuI | I-PpoI | I-SceI |
| KflI | KpnI | Kpn2I | KspI | KspAI | MauBI | MreI |
| MroI | MspCI | OliI | PacI | PaeR7I | PalAI | PaqCI |
| Pfl23II | PI-PspI | PI-SceI | PinAI | PmaCI | PmlI | PpuMI |
| PshAI | Psp5II | PspCI | PspEI | PspLI | PspPPI | PspXI |
| PsrI | RgaI | RigI | SacII | SanDI | SfaAI | SfiI |
| Sfr274I | Sfr303I | SgfI | SgrBI | SgsI | SlaI | SmiI |
| SrfI | SspBI | SstII | SwaI | TstI | Vha464I | XbaI |
| XhoI |
pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag中的单酶切位点包括：
| AhdI | AvaI | AvrII | BamHI | BbsI | BbvCI | BglII |
| BmeT110I | BmgBI | BmtI | BsmI | BsoBI | BspDI | BssHII |
| BstBI | BstXI | BstZ17I | ClaI | CsiI | DraIII | Eco53kI |
| EcoNI | MfeI | MluI | NdeI | NheI | NotI | NruI |
| PasI | PciI | PflFI | PflMI | PfoI | PmeI | PvuI |
| RsrII | SacI | ScaI | SexAI | SgrAI | SgrDI | SmaI |
| SnaBI | SpeI | SspI | TspMI | Tth111I | XmaI |
pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag质粒中推荐使用的测序引物序列如下：
CMV-F (769-789): 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
BGH-R (1936-1919): 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'
pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag的全序列信息:D3039 pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒).txt。
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D3039-1µg | pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag | 1µg |
| D3039-100µg | pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag | 100µg |
| － | 说明书 | 1份 |
-20℃保存。
注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
图2. 碧云天pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒)推荐的使用流程图。
5.细胞裂解。
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