使用说明：
1.首次使用1µg包装的本产品时，请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.25µg/µl，共400µl。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.质粒构建。
在多克隆位点(Multiple cloning sites, MCS)中选择1或2个限制性内切酶位点插入诱饵蛋白的基因片段。
注：克隆时须保持APEX2与诱饵蛋白的碱基序列在同一阅读框中，避免因移码突变导致的诱饵蛋白不表达。
4.质粒转染。
a.在转染前一天将适量细胞(具体的细胞数量根据细胞类型、大小和细胞生长速度等确定) 分别接种到24/12孔板(用于Immunofluorescence)、6/12孔板(用于Immunoblot)或10cm细胞培养皿(用于Pull Down)内进行培养，使第二天细胞密度能达到约70-80%。
b.使用合适的转染试剂例如Lipo8000™或Lipo6000™分别将克隆有诱饵蛋白质粒(pCMV-N-mito-Flag-APEX2-Bait)或阴性对照质粒(pCMV-N-mito-Flag-APEX2)转染到细胞中。

图3. 碧云天pCMV-N-mito-Flag-APEX2质粒推荐的使用流程图。

5.免疫荧光(Immunofluorescence)检测融合有mito-Flag-APEX2的诱饵蛋白和被生物素标记的蛋白
a.24/12孔板在转染12-48小时后，吸尽培养液，更换为含有5-500μM的生物素衍生物的完全培养液或不含有生物素衍生物的完全培养液，继续培养30分钟。
注1：生物素衍生物包括生物素基酪氨酰胺(Biotin-tyramide)，也被称作生物素-苯酚(Biotin-phenol)，是APEX和APEX2最常用的生物素标记底物，但是其缺点是生物素标记后的背景较高，可能会导致后续鉴定困难。对生物素衍生物底物进行优化后，发现了体外反应活性更高，在活细胞内对蛋白质复合物标记更具选择性的生物素衍生物：生物素-4-氨基苯酚(Biotin-4-aminophenol)和生物素-萘胺(Biotin-naphthylamine, Biotin-nap)，其中生物素-萘胺还可以标记单链和双链DNA [5]。
注2：建议在5-500μM范围内对生物素衍生物使用浓度设置梯度，这对后续提高生物素标记蛋白与背景信噪比至关重要。
b.加入或不加入终浓度为1mM H₂O₂激活APEX2的过氧化物酶活性，室温孵育1分钟。
注：通常情况下1mM H₂O₂可以有效激活APEX2生物素标记相互作用的蛋白质，如有需要也可以对H₂O₂浓度、标记时间和标记温度进行梯度摸索，以寻找最适合的反应条件。
c.吸尽培养液，立即加入Quenching Buffer终止反应。
注1：Quenching Buffer (10mM Ascorbate, 10mM Sodium Azide, 5mM Trolox in 1X PBS)中的叠氮钠为有毒物质，因此在使用该试剂时必须采取必要的防护措施；
注2：Quenching Buffer处理细胞会导致线粒体呼吸链和细胞色素的功能受影响。
d.用Quenching Buffer洗涤细胞2次，去除Quenching Buffer，尽量确保没有液体残留。
e.加入0.5ml免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定液(P0099)，固定细胞10分钟或更长时间(可4℃固定过夜)。
注：也可以根据特定的一抗或样品采用有效成分为乙醇、甲醇或其它类型的固定液。
f.去除固定液，用免疫染色洗涤液(P0106)或TBSTx (ST675)洗涤3次，每次3-5分钟。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。去除洗涤液，尽量确保没有液体残留。
g.用免疫染色封闭液(P0102/P0260)或含5% BSA的TBSTx溶液封闭60分钟，请置于摇床上轻轻摇动。
h.去除封闭液，选用合适的一抗对融合有mito-Flag-APEX2的诱饵蛋白进行免疫荧光染色，孵育60分钟或在摇床上轻轻摇动孵育60分钟，为增强与一抗的结合，可以在4℃孵育过夜。可同时使用DAPI染色液(C1005)或Hoechst (C1011/C1017/C1018)对细胞核染色，荧光探针标记的Streptavidin可以对生物素标记的蛋白进行荧光染色。
注：推荐使用免疫染色一抗稀释液(P0103/P0262)或5% BSA的TBSTx溶液作为一抗稀释液。
i.去除一抗，用免疫染色洗涤液(P0106)或TBSTx (ST675)洗涤3-5次，每次3-5分钟。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。
j.去除洗涤液，选用合适的荧光标记的二抗避光孵育60分钟或在摇床上轻轻摇动孵育60分钟。
注：推荐使用免疫荧光染色二抗稀释液(P0108/P0265)或5% BSA的TBSTx溶液作为二抗稀释液。
k.用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟，期间注意避光。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。
l.使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察融合有mito-Flag-APEX2的诱饵蛋白表达、定位以及被生物素标记的蛋白。
6.免疫印迹法(Immunoblot)检测融合有mito-Flag-APEX2的诱饵蛋白和被生物素标记的蛋白
6/12孔板用于通过免疫印迹法检测融合有mito-Flag-APEX2的诱饵蛋白的表达和被生物素标记的蛋白。具体实验操作方法可参照碧云天网站的Western实验步骤：https://www.beyotime.com/support/western.htm
7.免疫沉淀(Pull Down)生物素标记蛋白。
10cm细胞培养皿用于通过免疫沉淀(Pull Down)纯化、富集生物素标记蛋白。
a.细胞裂解。
(a)选择合适的裂解液，用于制备细胞裂解液。推荐使用Western及IP细胞裂解液用于细胞(P0013)。如有必要，也可以使用RIPA裂解液(P0013B/P0013C/P0013D)用于样品的制备。如果使用自行配制的裂解液，需要确保裂解液的pH为6-8。
(b)具体的细胞裂解液的制备步骤请参考相应裂解液的使用说明。制备好的裂解液上清置于冰上或4℃存放，随后即可用于免疫沉淀。新鲜制备好的样品，建议尽量当天完成免疫沉淀等后续操作，但如果样品不能当天使用，也可以适当分装后-80℃冻存。
b.推荐使用BeyoMag™ Streptavidin Magnetic Beads (链霉亲和素磁珠) (P2151)，具体的免疫沉淀步骤请参考链霉亲和素磁珠的使用说明。
8.质谱(Mass Spectrometry)鉴定。
样品SDS-PAGE电泳后对凝胶进行考染或银染，切割感兴趣的目的条带进行质谱检测；也可以通过二维电泳后寻找差异点进行质谱分析；或者直接进行基于质谱的蛋白质组分析。
9.用于电子显微镜细胞成像(Electron Microscopy, EM)的DAB染色
a.加入常温含有2%戊二醛的缓冲液(100mM Sodium Cacodylate pH7.4, 2mM CaCl₂)固定转染的细胞，然后将细胞样品迅速移到冰上。
注1：戊二醛固定液有一定腐蚀性，因此在使用该试剂时必须采取必要的防护措施，请在通风较好的环境下小心操作，避免吸入；
注2：随后的所有步骤，温度都需保持在0-4℃之间，直至树脂完全浸润样品。
b.30-60分钟后，吸尽固定液，用预冷缓冲液(100mM Sodium Cacodylate pH7.4, 2mM CaCl₂)洗涤5次，每次2分钟。去除洗涤液，尽量确保没有液体残留。
c.加入预冷含有20mM Glycine的缓冲液淬灭未反应的戊二醛，置于冰上5分钟。
d.吸尽淬灭液，用预冷缓冲液洗涤5次，每次2分钟。去除洗涤液，尽量确保没有液体残留。
e.将预冷的新鲜用10mM (0.03% v/v) H₂O₂稀释的含有0.5mg/ml (1.4mM) DAB Tetrahydrochloride或DAB-free Base溶液加入细胞中，反应1-15分钟。
注：具体的DAB染色反应时间取决于样品，可通过透射光显微镜观察DAB氧化聚合交联生成局部沉淀的情况判断反应进行情况。
f.吸尽DAB染色液，用预冷缓冲液洗涤5次，每次2分钟。去除洗涤液，尽量确保没有液体残留。
g.加入预冷含有2% OsO₄对DAB聚合物进行染色产生EM对比，置于冰上30分钟。
h.吸尽OsO₄染色液，用预冷H₂O洗涤5次，每次2分钟。去除H₂O，尽量确保没有液体残留。
i.加入预冷2% Aqueous Uranyl Acetate，4℃过夜。
j.然后将样品依次在预冷的乙醇系列(20%, 50%, 70%, 90%, 100%, 100%)中各脱水2分钟，然后在室温无水乙醇中冲洗一次以避免凝结。
k.然后将样品在体积比为1:1的Durcupan ACM Resin和无水乙醇混合物中浸润30分钟。
l.然后将样品在100% Durcupan ACM Resin中浸润2次，每次1小时。
m.然后将样品放入新鲜树脂中，在60℃的真空炉中聚合48小时。
参考文献：
1.Rhee HW, Zou P, Udeshi ND, Martell JD, Mootha VK, Carr SA, Ting AY. Science. 2013. 339(6125):1328-1331.
2.Lam SS, Martell JD, Kamer KJ, Deerinck TJ, Ellisman MH, Mootha VK, Ting AY. Nat Methods. 2015. 12(1):51-4.
3.Huang MS, Lin WC, Chang JH, Cheng CH, Wang HY, Mou KY. Protein Sci. 2019. 28(9):1703-1712.
4.Martell JD, Deerinck TJ, Sancak Y, Poulos TL, Mootha VK, et al. Nat Biotechnol. 2012. 30(11):1143-8.
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