碧云天研发生产的BeyoCRISPR™ sgRNA Screening Kit，即BeyoCRISPR™ sgRNA筛选试剂盒，也称BeyoCRISPR™ sgRNA筛选试剂盒(BeyoCRISPR™ In Vitro sgRNA Screening Kit)，是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术而研发的、用于体外筛选高效的基因编辑用sgRNA的试剂盒。本试剂盒利用Cas9核酸酶在sgRNA介导下对靶DNA序列的体外切割特性，可以简单、可靠、快速地在体外检测sgRNA的效率，并筛选出高效的sgRNA。

CRISPR/Cas9是一项突破性的基因组编辑技术，操作便捷，应用广泛。CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一种原核生物利用RNA引导的DNA核酸酶Cas9对外源的噬菌体或病毒核酸进行基因沉默的获得性免疫系统(Adaptive immune system)，后续在此基础上逐渐发展为广泛应用于原核和真核生物的越来越成熟的基因编辑技术。该技术能够在sgRNA引导下通过Cas9对原核和真核生物的基因组DNA的靶向序列进行位点特异性的切割，然后通过易错修复(Error-prone repair)或同源重组(Homologous recombination)在切割位点改变或插入序列来产生移码突变，从而通过基因编辑而实现基因敲除。其中sgRNA确保识别位点的特异性。随着CRISPR技术的发展，该技术目前不仅可以实现基因敲除，还可以实现基因的点突变、插入突变等多种突变方式，特别是在临床应用方面可以用于修复不良突变等[1, 2]。同时通过构建没有内切酶活性的Cas9突变体dCas9，通过与dCas9直接融合表达或间接招募转录激活或转录抑制因子，可以实现sgRNA靶向基因的转录激活或转录抑制。

sgRNA (Single guide RNA)，也称gRNA，由18-20bp与靶基因序列互补的CRISPR RNA (crRNA)序列以及能与Cas9特异性结合的trans-activating crRNA (tracrRNA)序列组成。在细胞内，Cas9核酸酶可以特异性地结合sgRNA，同时sgRNA也能特异性地与相应的靶基因序列配对结合，这样就可以导致Cas9核酸酶在靶基因位点的PAM (Proto-spacer adjacent motif)序列NGG上游大约三个碱基的位置对靶基因进行切割。随后在细胞DNA修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换，从而可能产生移码突变，导致目的基因的缺失突变[1]。sgRNA的设计依赖于PAM位点附近的区域，但在通常情况下，即使满足上述所有要求的靶序列，其对应的sgRNA的特异性和活性也具有不可预测性。因此在实验中通常需要设计多个不同的sgRNA来靶向目的基因，并进行相应的筛选。

本试剂盒提供高活性的Cas9核酸酶(Cas9 Nuclease)，按照使用说明将待测试的体外转录的sgRNA与Cas9核酸酶结合后体外切割靶基因的DNA片段，通过凝胶电泳即可对多条sgRNA的靶向基因编辑效率进行有效评估，使用本试剂盒体外检测sgRNA靶向基因编辑效率的效果请参考图1。根据凝胶电泳形成的条带灰度比例可评估对应sgRNA的靶向基因编辑效率，体外(In vitro)筛选与进行体内(In vivo)细胞内实验后所测得的基因编辑效率规律基本一致，具体效果可参考图1。

图1.碧云天BeyoCRISPR™ sgRNA Screening Kit (D8412)体外筛选结果和细胞内实际基因编辑效果对比图。图A为本试剂盒体外筛选sgRNA靶向基因编辑效率的效果图。靶DNA片段大小约为720bp。sgRNA C为非靶向sgRNA的阴性对照；sgRNA 1为靶向GFP基因的，切割产生的DNA片段大小分别为451bp和269bp；sgRNA 2也是靶向GFP基因的，切割产生的DNA片段大小分别为490bp和230bp。图B为体外筛选结果和细胞内实际基因编辑效率对比图。体外(In vitro)筛选实验中sgRNA的靶向效率通过使用本试剂盒后进行凝胶电泳(如图A)，再由凝胶分析软件计算每个条带灰度值及比例所确定(具体请参考使用说明的步骤3)。对于体内(In vivo)细胞基因编辑实验，将HEK293T-EGFP报告细胞(EF1α-EGFP-IRES-Hygro HEK293T Cells (C7993))接种于六孔板中，待细胞融合度约为80%时，使用碧云天Lipo8000™转染试剂(C0533)分别将上述靶向GFP的sgRNA 1或sgRNA 2的编码质粒与Cas9蛋白的编码质粒(pCMV-Cas9-NLS (D8335))共转染至细胞中，同时转染编码非靶向GFP的sgRNA质粒(sgRNA C)作为阴性对照。转染5天后消化细胞进行流式细胞检测，根据GFP报告基因的平均荧光强度计算细胞基因编辑效率。由图中结果可以看出，使用本试剂盒进行sgRNA体外筛选的结果与实际基因编辑实验结果规律基本一致。实际效果会因样品种类、检测条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。

本试剂盒不包含sgRNA的体外转录试剂，推荐使用BeyoCRISPR™ One-Step sgRNA Synthesis Kit (D7081)或BeyoCRISPR™ Two-Step sgRNA Synthesis Kit (D7083)进行sgRNA的体外转录。

本试剂盒提供阳性对照靶DNA片段，大小约为823bp，经Cas9及阳性对照sgRNA切割后产生的DNA片段大小分别为525bp和298bp。

按使用说明操作，本试剂盒的小包装和中包装分别可用于20个或100个sgRNA样品的体外筛选。

-20ºC保存，一年有效。

酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20ºC保存。

Positive Control sgRNA以冻干粉末形式提供，首次使用在4ºC，12,000g离心5分钟后按照每250ng加入10µl Ultrapure Water的体积完全溶解，溶解后的浓度为25ng/µl，适当分装并置于-80ºC保存，使用过程中须避免反复冻融。

本试剂盒使用时会涉及gRNA和DNA的操作，必须注意RNase-free和DNase-free的相关操作。所有自行准备的试剂和耗材也都应是Nuclease-free的。如果可能有核酸酶污染，可考虑用0.01%的DEPC处理过夜，然后高温高压处理后使用。操作时建议戴一次性口罩操作。

对于操作环境中核酸酶的去除，推荐使用碧云天生产的RNase and DNase Away (R0123)以去除实验桌、仪器设备等表面或其它接触面上的核酸酶。反应体系中推荐加入RNase Inhibitor以保护RNA不被降解。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。