使用说明：
注1：本使用说明仅供参考，用户可根据实际使用的分离液或分离试剂盒产品说明书进行操作。碧云天提供人外周血淋巴细胞分离液(C0025)、大鼠外周血淋巴细胞分离试剂盒(C0027)、小鼠外周血淋巴细胞分离试剂盒(C0029)和兔外周血淋巴细胞分离试剂盒(C0031)，欢迎选购。
注2：本使用说明中的离心转速和时间适用于常规实验，用户可根据样品种类、样品放置时间、离心机种类及环境温度进行调节，以摸索最佳的离心条件。
注3：当样品体积为0.2-2ml时，建议使用5ml的PBMC高效离心管(FTUB405)；当样品体积为0.5-6ml时，建议使用15ml的PBMC分离管(FTUB415)；当样品体积为5-25ml时，建议使用50ml的PBMC分离管(FTUB450)。
1.实验前准备。
a.抗凝剂的选择。若分离出的淋巴细胞直接用于检测，可选用枸橼酸钠抗凝剂；若分离出的淋巴细胞需进一步培养，则选用肝素抗凝剂。
b.血液样品应是新鲜抗凝血，避免冷藏或冷冻。血液样品离体2小时内分离效果最佳；血液样品离体2-4小时，分离效果尚可；血液样品离体48小时以上，分离效果差或无法进行分离操作。
c.为保证最佳分离效果，整个实验过程要求检测样品、使用试剂、离心及实验室的温度均保持在20±2ºC。
2.血液样品的稀释。
使用等体积的稀释液稀释样品，例如，5ml稀释液加入5ml血液样品中，并轻轻混合。稀释液推荐含2%胎牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS+2% FBS)或其它合适的培养液。D-PBS推荐D-PBS (C0221D)。
注：用户也可根据实验需求调整稀释比例，如血液样品:稀释液=2:1。生理盐水稀释样品可能可以提高分离效果，如有需要可使用生理盐水进行稀释处理。
3.PBMC的分离。
a.加入分离液。取出分离液并平衡至室温，用移液管吸取适量分离液从BeyoGold™外周血淋巴细胞分离管分离嵌套的中心孔内加入，分离液须适量没过分离嵌套上方(above the insert)。
注：使用15ml的本分离管时，至少加入3ml分离液；使用50ml的本分离管时，至少加入13ml分离液。须确保分离液适量没过分离嵌套上方。
b.保持分离管垂直，用移液器吸取待分离的样品沿着管壁缓慢加入到分离管中。样品将与没过嵌套上方的分离液混合。
注：也可直接将样品倾倒进管内，但须避免样品经嵌套的中央小孔直接进入分离液中。
4.收集富集细胞。
a.室温1200×g离心10分钟，无须关闭离心机刹车。离心后，液体分离为4层，从上到下依次为血浆层(含血小板)、乳白色环状层(即PBMC层，包括淋巴细胞(Lymphocyte)和单核细胞(Monocyte))、分离液层和沉淀层(红细胞和粒细胞)。离心后须小心取出离心管，切勿摇晃或震动。血浆层和乳白色环状层在嵌套上方，统称为上层溶液。
注1：若样品放置超过24小时，则建议适当延长离心时间，如20分钟，可将红细胞分离的更好。
注2：不同品牌和型号的离心机在打开刹车时的减速效果可能不同。如果离心后看不到PBMC层或者PBMC的回收率较低，可将刹车速率降低至中或低。
注3：如有必要，可以通过增加离心时间、降低离心力进行离心，如室温离心30分钟，离心力为500×g (对于15ml分离管)或800×g (对于50ml分离管)。
b.将含PBMC层的上层溶液倒入另一干净普通离心管中。离心管推荐BeyoGold™ 15毫升锥形离心管(FTUB515)或BeyoGold™ 50毫升锥形离心管(FTUB550)。
注1：分离管中的分离嵌套可避免PBMC被红细胞和粒细胞再次污染，但分离管倒置时间不要超过2秒。
注2：收集或吸除PBMC所在层以上5-10mm的血浆层，可防止富集的细胞被血小板再次污染。
注3：离心后，分离管中分离嵌套的表面可能存在一些红细胞，这些红细胞不会影响分离效果。
5.单核细胞重悬。
a.加入适量稀释液，适当混匀，重悬细胞。室温300×g离心8分钟，弃上清。重复洗涤2次。
b.用适量PBS或合适的培养液将收集到的PBMC重悬备用。
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
C0025-200ml	人外周血淋巴细胞分离液	200ml
C0027S	大鼠外周血淋巴细胞分离试剂盒	200ml
C0029S	小鼠外周血淋巴细胞分离试剂盒	200ml
C0031S	兔外周血淋巴细胞分离试剂盒	200ml
FTUB405	PBMC高效离心管(5ml)	20个/100个
FTUB415	BeyoGold™外周血淋巴细胞分离管(15ml, 无菌独立包装)	10个/50个
FTUB450	BeyoGold™外周血淋巴细胞分离管(50ml, 无菌独立包装)	10个/50个