使用说明：
1.蛋白样品的准备。
a.蛋白样品的收集。根据实验需要，使用适当的裂解液，例如碧云天的Western及IP细胞裂解液(P0013/P0013J)、RIPA裂解液(P0013B/P0013C/P0013D/P0013K)、NP-40裂解液(P0013F)或SDS裂解液(P0013G)等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品；为了防止蛋白的降解，或保证磷酸化或乙酰化蛋白的稳定，也可额外添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂或去乙酰化酶抑制剂混合物(P1005/P1006/P1045/P1046/P1112/P1113)。也可以直接使用BeyoWB™ SDS-PAGE上样缓冲液(5X, 无气味)直接进行细胞或组织样品的裂解，但此时不太方便进行蛋白定量。
b.蛋白样品的定量(选做)。为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需选择适当的蛋白浓度测定方法。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液，可以使用碧云天的BeyoBCA蛋白浓度快速测定试剂盒(P0398)、BeyoBCA蛋白浓度测定试剂盒(高灵敏度) (P0399)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)、Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型) (P0006C)等产品。
c.蛋白样品的处理。取出试剂盒中的BeyoWB™ SDS-PAGE上样缓冲液(5X, 无气味)，在室温或不超过50ºC的水浴中溶解。溶解后，按照每4μl蛋白样品加入1μl BeyoWB™ SDS-PAGE上样缓冲液(5X, 无气味)的比例，混合蛋白样品和BeyoWB™ SDS-PAGE上样缓冲液(5X, 无气味)。混合后的样品使用95ºC水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。加热结束后，冷却到室温，即可用于后续电泳上样(步骤2d)。
注1: 如果使用水浴加热溶解BeyoWB™ SDS-PAGE上样缓冲液(5X, 无气味)，溶解后立即室温存放，避免长时间置于水浴中。使用完毕后宜尽快置于-20ºC保存，如有必要，可以适当分装后使用。
注2: 加热前如果发现蛋白样品内有粘稠的半透明状物体(通常由基因组DNA等形成)，通常在本上样缓冲液内95度水浴加热5分钟后消失。如果没有完全消失，可以延长95度水浴时间至8-10分钟，通常该粘稠的半透明状物体会完全消失，以便于后续的上样操作。适当超声或使用1ml注射器反复抽吸也可以打断基因组DNA从而使粘稠状物体消失。
注3: 样品请务必95ºC加热，温度过高(如100ºC)或时间过长(如超过15分钟)，有可能会导致蛋白降解或上样缓冲液中指示剂的颜色异常。
2.电泳。
a.电泳液的配制。量取50ml本试剂盒中提供的BeyoWB™ SDS-PAGE电泳液(Tris-Gly, 20X)，倒入到洁净的量筒中，加入超纯水、去离子水或蒸馏水定容到1L，混匀后即配制成BeyoWB™ SDS-PAGE电泳液(Tris-Gly, 1X)；也可根据所需的电泳液量自行配制。没有用完的电泳液可以室温保存，通常室温可保存2-3天，4ºC可保存1-2周。
b.安装预制胶。将试剂盒中提供的BeyoGel™ Elite PAGE预制胶(Tris-Gly, 4-20%, 15孔)从包装袋中取出，撕掉底部蓝色密封胶带；将预制胶固定在电泳槽中，平稳、缓慢地拔出梳子。
c.加入电泳液。内槽加满步骤2a中配制的电泳液，外槽则加入电泳液适当没过预制胶板即可，最高不可漫过胶板。通常，同时进行两块胶的电泳，使用500ml电泳液即可。电泳推荐使用碧云天的MiniProGel™蛋白电泳系统(2胶) (E6006)。
注：由于预制胶孔中可能有残留的储存缓冲液，所以建议用200μl或1ml移液器吸取电泳液轻轻吹打加样孔，将加样孔冲洗干净，去除气泡和残留的储存缓冲液，这样电泳的效果更佳。
d.上样。使用常规吸头或BeyoGold™凝胶电泳上样吸头(1-200μl) (FTIP205/FTIP206/FTIP208/FTIP209)吸取适当体积步骤1c中准备的蛋白样品，将吸头的尖端垂直方向轻轻插入到上样孔中即可上样，吸头避免戳破凝胶，更不能使胶板变形导致样品泄漏。最佳上样量可通过实验来确定，样品过量较易导致条带拖尾和信号过强。本试剂盒中提供的预制胶，每孔最大上样体积为30μl，常用的上样量为5-20μl。
e.电泳。将电泳槽盖子盖好，并将电源线插头插入电泳仪对应电源插孔。电泳电压建议为180V，电泳时间建议为25分钟。但不同电泳槽、不同气温等会影响电泳时间，实际通常电泳至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。电源推荐碧云天的BeyoPower™中电流电源(300V/600mA/100W) (E6080)或BeyoPower™高电流电源(300V/2000mA/200W) (E6085)。电泳结束后，取出胶板，用小螺丝刀、小撬板、BeyoGel™预制胶开胶器(FGO021)等沿两板间的缝隙将两板别开，掰开两个板，用刮板将凝胶轻轻取出，参考步骤3进行转膜。
3.转膜。在电泳时，宜做好转膜的准备工作，包括进行转膜液的配制、PVDF膜的活化等。
a.转膜液的配制。量取100ml本试剂盒中提供的BeyoWB™转膜液(10X)，倒入洁净量筒中，加入超纯水、去离子水或蒸馏水至总体积约700ml。加入200ml无水乙醇或210ml 95%乙醇，充分混匀。在量筒中用超纯水、去离子水或蒸馏水定容到1L，混匀后即为BeyoWB™转膜液(1X)，可用于转膜。
注1：配制好的BeyoWB™转膜液(1X)无需提前冷藏降温，配制好后即可使用。
注2：没有用完的BeyoWB™转膜液(1X)可在常温或4ºC保存，通常两周内可以正常使用。当转膜液颜色变为浅棕色或黄褐色时，应该丢弃。
b.PVDF膜的活化。使用Western专用的平头镊夹(FS035)或适当工具夹取本试剂盒中提供的BeyoWB™ PVDF膜(6.6×8.5cm, 0.45μm)边缘部分，小心取出。由于PVDF膜的高疏水性，膜需在乙醇、甲醇或其它适当的溶液中浸润活化后使用，推荐使用碧云天的安全无毒的PVDF膜浸润活化液(P0021S)。
c.PVDF膜和BeyoWB™转膜海绵垫使用转膜液浸泡。使用乙醇等浸润活化后的膜，需要使用适量的BeyoWB™转膜液(1X)进行浸泡和平衡，通常室温摇床摇动3-5分钟即可。海绵垫浸泡后可用赶气泡滚子(E6071)或移液管轻轻滚动将气泡赶出。
d.准备转移三明治。将转移三明治夹的黑色面向下，放置在洁净的器皿中(例如直径约15-20cm的圆皿)。在浸泡过的一片海绵垫上放置凝胶，注意排出凝胶与海绵垫之间的气泡。将用转膜液充分浸泡并完全湿润的印迹膜放在凝胶上，注意排出凝胶与印迹膜之间的气泡。将一片海绵垫放置在印迹膜上并排出所有气泡。上下适当用力夹紧转移三明治夹，用白色滑块锁住夹套，注意不要移动夹套中的三明治。转移三明治夹的黑色面对着转移电泳芯组件的黑色面，将转移三明治夹套插入转移电泳芯组件中。如果有两块凝胶，重复上述步骤制备另一个转移三明治夹。转膜推荐碧云天的MiniBlot™蛋白转膜系统系列产品(E6050/E6053)或MiniProGel™蛋白制胶、电泳与转膜系统系列产品(E6150/E6155/E6159)。
注1：将气泡完全排出是获得良好转移效果的关键，否则将严重影响最后的结果。每一步操作可使用赶气泡滚子轻轻滚动将气泡赶出。
注2：在转膜液中操作转移三明治，对气泡的排除有一定的帮助。
注3：三明治中无需使用转印槽中常规标配的多孔垫，无需使用转印滤纸。
e.转膜。向转印槽中倒入配制好的BeyoWB™转膜液(1X)，500mA恒流转膜10分钟，室温转膜，无需任何冰浴措施即可很好地完成转膜。如果使用非本试剂盒提供的凝胶，对于相对较小分子量蛋白或厚度为0.75mm凝胶，可以适当减少转膜时间；对于超过270kD的超大分子量蛋白或厚度为1.5mm凝胶，需要适当增加转膜时间。电源推荐使用碧云天的BeyoPower™高电流电源(300V/2000mA/200W) (E6085)或BeyoPower™中电流电源(300V/600mA/100W) (E6080)。
注：如果环境温度较高，也可酌情采取冰浴措施。
4.膜的封闭。
a.完成转膜后，立即把印迹膜(约6.6×8.5cm)放置到预先加入5ml BeyoWB™封闭液的Western洗膜盒(9.0×6.0×3.3cm) (FFX050)中，置于翘板摇床上缓慢摇动，室温封闭5分钟。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。后续如果无特殊说明，各种试剂的用量都以约6.6×8.5cm大小的印迹膜为例进行说明。
注1：经反复测试，室温封闭5分钟即可达到理想的封闭效果，但也可以根据实际情况酌情延长封闭时间。
注2：如果使用裁切后约2×8.5cm印迹膜，推荐使用2ml BeyoWB™封闭液，后续使用的各种试剂的体积也须相应按比例缩小。
5.一抗孵育。
a.一抗工作液的配制。根据一抗推荐稀释比例或优化后进行常规Western检测使用的稀释比例进行一抗工作液的配制。例如一抗推荐稀释比例为1:1000时，则在5ml BeyoWB™抗体稀释液中加入5μl一抗并混匀，即可得到5ml一抗工作液；如果推荐稀释比例为1:500，则在5ml BeyoWB™抗体稀释液中加入10μl一抗并混匀。
b.用微型台式真空泵、移液器或滴管等吸尽用于封闭的BeyoWB™封闭液。推荐使用BeyoVac™基础型台式真空吸液器(E6878)或BeyoVac™调速型台式真空吸液器(E6883)。
c.加入5ml一抗工作液。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，推荐用量为2ml。
d.置于翘板摇床上缓慢摇动，室温孵育15分钟。
注1：经反复测试，室温孵育15分钟即可达到理想检测效果，但也可以根据实际情况酌情延长一抗孵育时间。
注2：一抗孵育时，请参考步骤3a进行二抗工作液的配制。
e.回收一抗工作液，留待后续重复使用。并吸净残留的一抗工作液。
f.使用BeyoWB™ Western洗涤液洗涤3次，每次的用量为10ml，每次30秒。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，每次的推荐用量为4ml。每次推荐使用真空泵吸净残留的洗涤液。
注：经反复测试，洗涤3次，每次30秒，即可达到理想效果，但也可以根据实际情况每次酌情延长洗涤时间或增加洗涤次数。
6.二抗孵育。
a.二抗工作液的配制。通常建议根据二抗推荐稀释比例或优化后进行常规Western检测使用的稀释比例的2倍进行二抗工作液的配制。例如二抗推荐稀释比例为1:1000时，则在本试剂盒中使用的比例为1:500，即在5ml BeyoWB™抗体稀释液中加入10μl二抗并混匀，即可得到5ml二抗工作液。
b.加入5ml二抗工作液。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，推荐用量为2ml。
c.置于翘板摇床上缓慢摇动，室温孵育5分钟。
注：经反复测试，室温孵育5分钟即可达到理想检测效果，但也可以根据实际情况酌情延长抗体孵育时间。
d.回收二抗工作液，留待后续重复使用。并吸净残留的二抗工作液。
e.使用BeyoWB™ Western洗涤液洗涤3次，每次的用量为10ml，每次30秒。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，每次的推荐用量为4ml。每次推荐使用真空泵吸净残留的洗涤液。
7.蛋白检测。
a.BeyoWB™ BeyoECL工作液的配制。混合0.5ml BeyoWB™ BeyoECL A液和0.5ml BeyoWB™ BeyoECL B液，配制成1ml BeyoWB™ BeyoECL工作液，室温放置备用。工作液宜在临检测前配制。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，BeyoWB™ BeyoECL工作液配制0.4ml即可。
b.用WB专用镊子(FS035)将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体(切勿接触膜的蛋白面)，然后置于一洁净保鲜膜上。
c.滴加1ml BeyoWB™ BeyoECL工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置30秒。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，BeyoWB™ BeyoECL工作液的推荐用量为0.4ml。
注：通常放置30秒就可以进行后续的成像或压片检测，但也可以根据实际情况酌情延长放置时间。
d.取膜，弃BeyoWB™ BeyoECL工作液，用吸水纸略吸去过多的液体。将膜放在两片保鲜膜中间，随后进行化学发光成像仪检测或压片检测。
8.(选做)一抗二抗的去除与内参蛋白的检测。
推荐使用碧云天的Western一抗二抗去除液(中性) (P0025N)去除一抗和二抗用于后续其它目的蛋白的检测。如果希望进行内参蛋白的检测，推荐使用碧云天的Actin超快速Western检测试剂盒(P0970)、GAPDH超快速Western检测试剂盒(P0971)和Tubulin超快速Western检测试剂盒(P0972)，仅需10分钟就可以实现从膜到目的条带。
注：详细的Western实验步骤可以参考碧云天的相关网页：http://www.beyotime.com/support/western.htm。
参考文献：
1.Begum H, Murugesan P, Tangutur AD. Biotechniques. 2022. 73(1): 58-69.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
P0001	BeyoWB™ 30分钟Western检测试剂盒	6-15次/30-75次
P0002	BeyoWB™ 80分钟电泳转膜与Western检测试剂盒	6-15次/30-75次
P0946	BeyoWB™ HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)	200μl/1ml
P0948	BeyoWB™ HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)	200μl/1ml
P0950	BeyoWB™封闭液	100ml/500ml
P0951	BeyoWB™抗体稀释液	100ml/500ml
P0952-500ml	BeyoWB™洗涤液	500ml
P0953-100ml	BeyoWB™洗涤液(10X)	100ml
P0955	BeyoWB™ BeyoECL	100ml/500ml
P0956	BeyoWB™ 30分钟Western检测试剂盒(小鼠一抗用)	6-15次/30-75次
P0958	BeyoWB™ 30分钟Western检测试剂盒(兔一抗用)	6-15次/30-75次
P0963	BeyoWB™ SDS-PAGE上样缓冲液(5X, 无气味)	2ml/15ml
P0965	BeyoWB™ PVDF膜(6.6×8.5cm, 0.45μm)	20张/100张
P0966	BeyoWB™转膜海绵垫(免滤纸)	20片/100片
P0967	BeyoWB™ SDS-PAGE电泳液(Tris-Gly, 20X)	100ml/500ml
P0968	BeyoWB™转膜液(10X)	500ml/4×500ml
P0970	Actin超快速Western检测试剂盒	6-15次/30-75次
P0971	GAPDH超快速Western检测试剂盒	6-15次/30-75次
P0972	Tubulin超快速Western检测试剂盒	6-15次/30-75次
P0981	Flag标签蛋白超快速Western检测试剂盒	6-15次/30-75次
P0982	HA标签蛋白超快速Western检测试剂盒	6-15次/30-75次
P0983	Myc标签蛋白超快速Western检测试剂盒	6-15次/30-75次
P0984	His标签蛋白超快速Western检测试剂盒	6-15次/30-75次
P0985S	His标签蛋白(C-Terminal)超快速Western检测试剂盒	6-15次
P0986	GFP标签蛋白超快速Western检测试剂盒	6-15次/30-75次
P0987S	GST标签蛋白超快速Western检测试剂盒	6-15次
P0988S	V5标签蛋白超快速Western检测试剂盒	6-15次
P0990S	MBP标签蛋白超快速Western检测试剂盒	6-15次
P0992S	StrepII标签蛋白超快速Western检测试剂盒	6-15次
P0997S	AVI标签蛋白超快速Western检测试剂盒	6-15次
P0025N	Western一抗二抗去除液(中性)	250ml