使用说明：
1.样品的制备。
a.选择合适的裂解液，用于制备细胞或组织的裂解液。优先推荐选择碧云天生产的P0013 Western及IP细胞裂解液用于细胞或组织样品的裂解。根据特定的实验目的，如有必要，也可以使用碧云天生产的P0013B RIPA裂解液(强)、P0013C RIPA裂解液(中)或P0013D RIPA裂解液(弱)用于样品的制备。如果使用自行配制的或其它公司生产的裂解液，需要确保裂解液的pH为6-8。
b.具体的细胞或组织样品裂解的制备步骤请参考裂解液的使用说明。制备好的裂解液上清宜置于冰上或4ºC存放，随后即可用于免疫沉淀或免疫共沉淀、标签蛋白的纯化等操作。新鲜制备好的样品，建议尽量当天完成免疫沉淀等后续操作，但如果样品不能当天使用，也可以适当分装后-80ºC冻存。
2.Protein L磁珠的准备。
由于Protein L磁珠储存在特殊保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。
a.用移液器轻轻吹打重悬Protein L磁珠，按照每500μl样品10μl或20μl磁珠悬浊液，取适量Protein L磁珠至一洁净离心管中(FTUB015)，加入1X TBS (ST661/ST665)至最终体积为约0.5ml。说明：如果初始体积大于0.2ml，可以考虑先直接置于磁力架(FMS012/FMS024)上分离10秒，去除上清，然后再加入1X TBS (ST661/ST665)至最终体积为约0.5ml。
b.用移液器轻轻吹打重悬Protein L磁珠。置于磁力架(FMS012/FMS024)上分离10秒，去除上清。重复上述步骤两次。
c.按照初始体积的量，用1X TBS (ST661/ST665)重悬ProteinL磁珠。
3.抗体与Protein L磁珠的结合。
a.抗体的准备：按抗体使用说明中推荐的稀释比例用1X TBS稀释抗体，配制成抗体工作液；或将抗体配制成终浓度5-50μg/ml的抗体工作液。置于冰上备用。可选做：使用抗体种属相同的正常IgG配制相同稀释比或终浓度的正常IgG工作液，以用于去除非特异性结合或作为阴性对照。所谓种属相同的正常IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的抗体是小鼠IgG，则在本步骤中可以用1X TBS稀释适量的normal mouse IgG以用于降低背景或作为阴性对照。
b.抗体吸附：将步骤2准备好的Protein L磁珠进行磁性分离，吸除上清，加入500μl抗体工作液或正常IgG工作液，重悬后在室温翻转混合仪上翻转孵育15分钟-1小时。注：也可以直接在步骤2的Protein L磁珠中加入适量抗体或正常IgG进行孵育。
c.洗涤：加入500μl的1X TBS，用移液器轻轻吹打重悬Protein L磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复洗涤三次。按照初始体积的量，用1X TBS重悬Protein L磁珠。注：孵育和洗涤过程中，如果磁珠发生聚团或呈片状属正常现象，不会影响实验结果。
4.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):
a.去除非特异性结合(可选做)：步骤3中准备的结合了正常IgG的Protein L磁珠与样品4ºC孵育1小时后磁性分离，上清样品用于后续实验。本实验步骤的目的是去除与正常IgG产生非特异性结合的蛋白。
b.样品与结合了抗体或正常IgG的Protein L磁珠孵育。按照每500μl蛋白样品加入10μl或20μl磁珠悬浊液的比例加入结合了抗体或正常IgG的ProteinL磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育2小时或4ºC孵育过夜。
注1：孵育过程中，如果磁珠发生聚团或呈片状属正常现象，不会影响实验结果。
注2：也可先将适量抗体或正常IgG与样品室温孵育1-2小时或4ºC孵育过夜后，再加入10-20μl磁珠悬浊液室温孵育1小时。具体见常见问题2。
c.磁分离。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测免疫沉淀的效果。
d.洗涤。加入500μl的1X TBS，用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复洗涤三次。注：也可以通过检测洗涤得到的洗涤液的OD280来判断是否洗涤完全，若OD280大于0.05，应适当增加洗涤次数。
5.洗脱：
根据目的蛋白的特点及后续实验要求，可以选择如下方法之一进行洗脱。
a.酸性洗脱法：本方法为非变性法，比较快速且高效。洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。
(a)溶液的配制：酸性洗脱液(0.1M Glycine-HCl, pH3.5)，中和液(0.5M Tris-HCl, pH7.4, 1.5M NaCl)。
(b)每10-20μl原始磁珠体积，加入100μl酸性洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。注：孵育时间不宜超过15分钟。注：洗脱液的体积可以酌情适当调整，同时须注意后续的中和液体积也需要作相应调整。
(c)孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中，并加入10μl中和液，适当混匀。
(d)洗脱并中和的目的蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC长期保存。
b.SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法：本方法为变性法，得到的蛋白样品适合SDS-PAGE电泳或Western检测。
(a)SDS-PAGE上样缓冲液的配制：可以直接使用碧云天生产的P0015A SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)，或使用碧云天生产的P0015 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)或自行参考《分子克隆》等配制5X或2X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，然后加入水配制成1X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。通常SDS-PAGE蛋白上样缓冲液含有DTT等还原剂，其洗脱得到的蛋白样品中会含有抗体的轻链和重链。
(b)每10-20μl原始磁珠体积的磁珠，加入100μl 1X SDS-PAGE上样缓冲液，95ºC加热5分钟。注：洗脱液的体积可以酌情适当调整。
(c)置于磁力架上分离10秒，取上清进行SDS-PAGE电泳或Western检测。
c.多肽竞争洗脱法：如果目的蛋白是标签蛋白，并使用相应的标签抗体进行免疫沉淀，则可使用相应的多肽进行竞争洗脱。本方法为非变性法，洗脱效率高，且洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。以下以Flag标签蛋白为例：
(a)3X Flag多肽洗脱液的配制：取适量3X Flag多肽(P9801)溶解于1X TBS中，使其终浓度为150μg/ml，或稀释5mg/ml的3X Flag多肽溶液(P9801)至150μg/ml。
(b)每10-20μl原始磁珠体积，加入100μl 3X Flag多肽洗脱液(150μg/ml)，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温摇晃孵育30-60分钟，或4ºC孵育1-2小时。为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱。
(c)孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中。上清即为洗脱的Flag标签蛋白。
(d)洗脱的Flag标签蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC长期保存。
6.免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP):
参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(Co-IP)通常宜使用未经冻存的新鲜蛋白样品，以确保蛋白复合物不会因为冻融而被破坏。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但通常使用新鲜的蛋白样品更佳。
7.抗体的纯化：
a.参照步骤3，把Protein L磁珠加入到待纯化的抗体样品中，混匀后室温侧摆摇床或旋转混合仪上孵育1小时。吸去上清，然后用1X TBS洗涤3次。
b.参照步骤5a，用适量酸性洗脱液进行洗脱，并用中和液进行中和。
常见问题：
1.如何提高抗体与磁珠结合效率？
磁珠与抗体的结合效率与抗体的种属来源及所属亚型有关，如抗体所属亚型与Protein L亲和力较低，可以通过增加抗体与磁珠的孵育时间、提高TBS的pH值(8-9)或降低离子强度(25-100mM NaCl)等方法提高亲和力。
2.如何提高磁珠在免疫沉淀或免疫共沉淀反应中的特异性?
a.参考步骤4b中的备注，可以先将适量抗体与样品进行孵育，形成抗体-抗原复合物，再用Protein L磁珠捕获复合物，这样可以提高抗体与抗原的结合效率，并降低磁珠与样品接触的时间，从而提高沉淀产物的特异性。对于蛋白质/核酸共沉淀或染色质免疫共沉淀也推荐使用此方法。
b.参考步骤4a，使用结合了正常IgG的磁珠与蛋白样品预孵育，可以减少抗体的非特异性结合。类似地，也可以在蛋白样品中先加入正常IgG预孵育，然后再加入抗体进行孵育，随后再加入磁珠进行抗体的免疫沉淀。
c.设置正常IgG作为抗体的对照，可以确定免疫沉淀或免疫共沉淀产物的特异性。
3.如何避免磁珠在储存或使用过程中可能出现的聚集情况？
磁珠通常应保存在2-8ºC，使用时应避免由于污染而导致的不可逆聚集，或因干燥而导致的聚集。磁珠在低pH的洗脱缓冲液中发生聚集属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。在TBS和洗脱缓冲液中添加终浓度为0.1% (v/v)的非离子型去垢剂，如Triton X-100、Tween-20或NP-40，可有效防止磁珠聚集。经过低pH洗脱操作的磁珠可以用TBS洗涤至中性，然后用含有0.1% (v/v) Tween-20的TBS振荡重悬磁珠，并用超声波水浴处理2分钟，即可使磁珠恢复均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。
4.如何解决磁珠易粘附在离心管等耗材表面的现象？
建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外，在缓冲液中添加0.1% (v/v)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可以有效降低磁珠在耗材表面的粘附。
5.磁珠在使用过程中出现结块现象？
磁珠在使用时如果出现结块现象，容易导致分布不均。出现该问题的原因是磁珠在磁场中放置太久而使磁珠牢固的结合在一起。用超声波水浴处理2分钟即可打散磁珠使其重新分散，但应注意超声处理也会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落，所以磁珠在加样后洗脱前不宜使用该方法处理磁珠的结块问题。
6.其它常见问题、原因及解决方法：

Problem	Possible Causes	Solution
Very few or no target protein exists in the eluate.	Protein is not completely eluted.	Change elution methods.
	No target protein expressed.	Make sure the protein of interest contains the target protein by Western blot or dot blot analyses.
	Very low protein expression level.	1. Use larger volume of cell lysate. 2. Optimize expression conditions to raise the protein expression level.
	Washes are too stringent.	Reduce the time and number of washes.
	Incubation times are inadequate.	Increase the incubation time.
	Interfering substance is present in sample.	Lysates containing high concentration of DTT, 2-mercaptoethanol, or other reducing agents may destroy antibody function, and must be avoided.
	Detection system is inadequate.	If Western blot detection is used: 1. Check primary and secondary antibodies using proper controls to confirm binding and reactivity. 2. Verify that the transfer was adequate by using prestained protein marker or staining the membrane with Ponceau S. 3. Use fresh detection substrate or try a different detection system.
Background is too high.	Proteins bind nonspecifically to the antibody, insufficient washing on magnetic beads, or the microcentrifuge tubes.	1. Pre-clear lysate with Normal IgG to remove nonspecific binding proteins. 2. After suspending beads for the final wash, transfer entire sample to a clean microcentrifuge tube before separation.
	Washes are insufficient.	1. Increase the number of washes. 2. Prolong duration of the washes, incubating each wash for at least 15 minutes. 3. Increase the salt and/or detergent concentrations in the wash solutions. 4. Centrifuge at lower speed to avoid nonspecific trapping of denatured proteins.
Multiple protein bands found in the eluate.	The protein is not stable at room temperature.	Purify the target protein at lower temperature, such as 4ºC.
	Protein degradation due to proteases activity during purification process.	Add protease inhibitors to cell lysate.
	Non‐specific binding.	1. Prepare cell lysate again. 2. Add additional wash steps.

参考文献：
1.Housden NG, Harrison S, Roberts SE, Beckingham JA, et al. Biochem Soc Trans. 2003.31(Pt 3):716-8.
2.Li Y, Li B, Liu Y, Wang H, He M, et al. J Dent Sci. 2021. 16(4):1255-1263.
3.Lou YY, Zheng X, Huang YP, Mu L, Zhang XG, et al. Bioorg Chem. 2021. 116:105357.
4.Wang H, He F, Liang B, Jing Y, Zhang P, et al. J Cell Mol Med. 2021. 16(4):1255-1263.
5.Xu ZH, Su X, Yang G, Qin T and Liu Y. J Pharm Pharmacol. 2021. 16(4):1255-1263.
6.Yin Z, Geng X, Zhang Z, Wang Y and Gao X. Front Pharmacol. 2021. 12:746711.
7.Zhang S, Zhang D, Yi C, Wang Y, Wang H, et al. Oncol Rep. 2021. 46(5).
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