使用说明：
1.缓冲液的准备。
参考下表，根据具体的实验用途配制相应的缓冲液。

Buffer	Components
Coupling Buffer	50mM Tris-HCl, 5mM EDTA-Na (pH8.5)
Blocking Buffer	50mM L-Cysteine·HCl in Coupling Buffer
Storage Buffer	1X PBS (pH8.0) containing 20% Ethanol
Binding/Wash Buffer	1X PBS (pH8.0)
Elution Buffer	100mM Glycine·HCl, pH2.0-2.5
Neutralizing Buffer	1M Tris·HCl, pH8.5

注1：所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm (FF342/FF362/FF372)或0.45μm (FF345/FF365/FF375)孔径滤膜过滤，以减少杂质，提高蛋白纯化效率。
注2：推荐的缓冲液适用于大多数目标生物配体的固定和后续的亲和纯化，也可根据目的蛋白的稳定性更换其它缓冲体系。对于特殊样品，需自行进行适当的优化。
2.样品的制备。
a.本产品结合含有游离巯基的抗原、多肽或蛋白，对于合成的抗原、多肽或重组蛋白，实验前建议使用Ellman法检测蛋白是否存在游离巯基。推荐使用碧云天游离巯基检测试剂盒(DTNB法) (S0138)。如果确定含有游离巯基，将0.1-1mg抗原、多肽或蛋白样品溶于100μl-1ml Coupling Buffer中。
b.多肽或蛋白样品还原：若多肽或蛋白中不含游离的巯基，可使用还原剂断开二硫键，暴露出游离巯基。先将0.1-1mg多肽或蛋白样品溶于100μl-1ml Coupling Buffer，再加入TCEP至终浓度为25mM。推荐使用碧云天TCEP (DTT Substitute) (ST045)。
注1：TCEP是一种高效、无异味、不含硫醇基的水溶性还原剂，是DTT的替代物，可选择性还原多肽或蛋白质中的二硫键。而且由于不含巯基，不会干扰碘乙酰基的偶联，因此，还原后的多肽或蛋白样品上柱前不需要进行脱盐或透析处理。
注2：TCEP会干扰BCA法对蛋白浓度的测定，使用TCEP还原后的蛋白，不建议采用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。
3.碘乙酰琼脂糖凝胶准备。
a.吸取琼脂糖凝胶。轻轻重悬碘乙酰琼脂糖凝胶，尽量形成均匀的凝胶悬浊液，取20-100μl置于BeyoGold™ 1.5毫升离心管(无色, Nuclease free) (FTUB306)中待用。注：使用大孔径吸头(如用剪刀剪去部分吸头)吸取凝胶悬浊液会比较方便。
b.洗涤琼脂糖凝胶。加入Coupling Buffer至最终体积为约0.5ml，轻轻重悬碘乙酰琼脂糖凝胶。600×g在4ºC离心5分钟，小心去除上清，不要吸到凝胶。再重复洗涤2次。最终去除上清，并根据后续实验目的，用适量适当溶液重悬碘乙酰琼脂糖凝胶。
注1：通常每个样品的琼脂糖凝胶用量约为20-100μl。具体可根据目标生物配体浓度，参考产品主要指标表中琼脂糖凝胶的“Binding capacity”，计算目标生物配体的加入量。根据不同的实验目的，例如可以考虑目标生物配体的加入量为琼脂糖凝胶载量的1-2倍，使琼脂糖凝胶饱和，即把琼脂糖凝胶充分利用，此时通常实验目的是分离纯化；再例如加入琼脂糖凝胶的载量是待分离纯化的目标生物配体的2-3倍，以确保目标生物配体能被充分分离纯化，此时通常实验目的是为了对样品中的目标生物配体进行定量分析。
注2：多个样品时，可以取总琼脂糖凝胶量合并洗涤处理后再平分到各个样品管中，洗涤液用量须相应增加。
注3：也可参考相关方法进行填柱并使用重力柱法或FPLC法进行纯化。
4.偶联含巯基样品(以抗原样品为例)。
a.琼脂糖凝胶重悬。接步骤3b，用2倍原始琼脂糖凝胶体积的Coupling Buffer重悬碘乙酰琼脂糖凝胶。
b.偶联。加入适量步骤2中用Coupling Buffer稀释的样品，轻轻重悬碘乙酰琼脂糖凝胶，置于旋转混合仪上，室温孵育30-60分钟。
注：如有必要，可以在2-8ºC旋转混合1小时，以防止目标蛋白降解。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。
c.洗涤。取1ml Coupling Buffer加入碘乙酰琼脂糖凝胶中，轻轻重悬碘乙酰琼脂糖凝胶，600×g在4ºC离心5分钟，吸取并保留上清用于测定蛋白浓度以测定偶联效率，去除剩余的上清，不要吸到凝胶。再重复洗涤3次。
注：可通过未偶联前抗原浓度和偶联后上清的抗原浓度，计算并确定抗原的偶联效率。如果用于去除样品中含巯基的多肽或蛋白，本步骤吸取并保留的上清即为所需获得的样品。如有需要，可以通过检测结合前后上清液中游离的多肽或蛋白量的差值来计算去除率。
d.封闭。加入与原始琼脂糖体积相同的Blocking Buffer，盖上盖子，置于旋转混合仪上，室温孵育30分钟。封闭好后，600×g在4ºC离心5分钟，去除上清，不要吸到凝胶。
e.储存。如果立即使用，直接进入纯化抗体步骤。如果以后再使用，先取1ml Binding/Wash Buffer加入碘乙酰琼脂糖凝胶中，轻轻重悬碘乙酰琼脂糖凝胶，600×g在4ºC离心5分钟，去除上清，不要吸到凝胶，再重复洗涤3次。再加入2倍原始琼脂糖凝胶体积的Storage Buffer 2-8ºC储存。注：需避光储存，严禁冻结。
5.纯化抗体。
a.洗涤琼脂糖凝胶。接步骤4e，加入Binding/Wash Buffer至最终体积为约0.5ml，轻轻重悬琼脂糖凝胶。600×g在4ºC离心5分钟，小心去除上清，不要吸到凝胶。重复本洗涤步骤2次，即共洗涤3次。最终去除上清，并根据后续的实验目的，用适量的适当溶液重悬琼脂糖凝胶。
b.抗体结合。加入适量用Binding/Wash Buffer稀释的抗体，轻轻重悬偶联琼脂糖凝胶，置于旋转混合仪上，室温孵育30-60分钟。注：如有必要，可以在2-8ºC旋转混合1小时，以防止目标蛋白降解。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。
c.洗涤。取1ml Binding/Wash Buffer加入琼脂糖凝胶中，轻轻重悬琼脂糖凝胶，600×g在4ºC离心5分钟，去除上清，不要吸到凝胶。再重复洗涤3次。
d.洗脱。根据目的生物配体的特点及后续实验要求，可以选择如下方法之一或其它合适方法进行洗脱。
(a)酸性洗脱缓冲液洗脱。每个样品加入100μl Elution Buffer，混匀后置于旋转混合仪上，室温孵育5分钟，置于离心机中600×g在4ºC离心5分钟，将上清转移到新的离心管中，立即加入10μl Neutralizing Buffer，适当混匀。洗脱液置于4ºC待用，或者-20ºC长期保存。
注：酸性洗脱缓冲液能破坏绝大部分的抗体与抗原的相互作用。但为了确保更好的洗脱效果，可预先用300µl 0.1% Tween-20的水溶液洗涤琼脂糖凝胶1次。
(b)SDS-PAGE Loading Buffer或0.1% SDS洗脱。每个样品加入100μl或适量的1X SDS-PAGE Loading Buffer或0.1% SDS，95ºC加热3分钟。置于离心机中600×g在4ºC离心5分钟，取上清用于SDS-PAGE电泳检测等。
注1：如果选择SDS-PAGE Loading Buffer或0.1% SDS进行洗脱，那么洗脱液将包含抗体和少量抗原。
常见问题：

Problem	Possible Causes	Solution
Protein/peptide precipitates in Coupling Buffer.	Protein/peptide was not soluble in Coupling Buffer.	Dissolve sample in ≤30% DMSO or DMF or 6M Guanidine·HCl in Coupling Buffer.
Low coupling efficiency.	Sulfhydryls were oxidized.	Reduce protein/peptide with DTT or TCEP and proceed immediately with desalting and coupling procedure to prevent reformation of disulfide bonds.
	Sulfhydryl-containing reductant was not removed from sample.	(1) Remove reductant from the reduced sample using a desalting column before coupling agarose. (2) Reduce sample using TCEP.
Column flows exceedingly slow.	Air bubbles in column.	Remove air bubbles by stirring or centrifugation the agarose.
The purity of elution fraction is low.	The column was not washed thoroughly.	Increase the volume of Binding/Wash Buffer.

参考文献：
1.F Dickens. Biochemical Journal. 1933. 27 (4): 1141–1151.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
P2015-2ml	Protein A Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	2ml
P2015-10ml	Protein A Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	10ml
P2015-50ml	Protein A Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	50ml
P2015-200ml	Protein A Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	200ml
P2017-2ml	Protein G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	2ml
P2017-10ml	Protein G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	10ml
P2017-50ml	Protein G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	50ml
P2017-200ml	Protein G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	200ml
P2019-2ml	Protein A+G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	2ml
P2019-10ml	Protein A+G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	10ml
P2019-50ml	Protein A+G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	50ml
P2019-200ml	Protein A+G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	200ml
P2157-1ml	Biotin Agarose (生物素琼脂糖凝胶)	1ml
P2157-5ml	Biotin Agarose (生物素琼脂糖凝胶)	5ml
P2157-20ml	Biotin Agarose (生物素琼脂糖凝胶)	20ml
P2159-1ml	Streptavidin Agarose (链霉亲和素琼脂糖凝胶)	1ml
P2159-5ml	Streptavidin Agarose (链霉亲和素琼脂糖凝胶)	5ml
P2159-20ml	Streptavidin Agarose (链霉亲和素琼脂糖凝胶)	20ml
P2165-1ml	Heparin Agarose (肝素琼脂糖凝胶)	1ml
P2165-5ml	Heparin Agarose (肝素琼脂糖凝胶)	5ml
P2165-20ml	Heparin Agarose (肝素琼脂糖凝胶)	20ml
P2169-1ml	Iodoacetyl Agarose (碘乙酰琼脂糖凝胶)	1ml
P2169-5ml	Iodoacetyl Agarose (碘乙酰琼脂糖凝胶)	5ml
P2169-20ml	Iodoacetyl Agarose (碘乙酰琼脂糖凝胶)	20ml
P2169-100ml	Iodoacetyl Agarose (碘乙酰琼脂糖凝胶)	100ml
S0138S	游离巯基检测试剂盒(DTNB法)	100-200次
S0138M	游离巯基检测试剂盒(DTNB法)	500-1000次
ST043-1g	DTT	1g
ST043-5g	DTT	5g
ST043-25g	DTT	25g
ST043-100g	DTT	100g
ST045-1g	TCEP (DTT Substitute)	1g
ST045-5g	TCEP (DTT Substitute)	5g
ST045-25g	TCEP (DTT Substitute)	25g
ST045-100g	TCEP (DTT Substitute)	100g