使用说明：
对于用镍柱纯化大肠杆菌中His标签蛋白比较熟悉的使用者可以直接参考“6. 简化的操作流程”。否则请参考如下详细内容：
如下以最常见的大肠杆菌中表达纯化His标签重组蛋白为例，说明本产品的使用方法。在其它体系中表达时，请参考该表达体系的相关使用说明，并借鉴大肠杆菌中纯化His标签重组蛋白的使用说明。
1.大肠杆菌中His标签重组蛋白的诱导表达：
如下以最常用的IPTG诱导表达系统给予说明，诱导表达条件的优化请参照所使用的诱导表达体系的详细说明。其它诱导表达系统请参考适当的使用说明进行。
a.挑取表达His标签重组蛋白的单克隆，接种到3ml或10-20ml含适当抗生素的LB培养液中，培养过夜。
b.按照1:20的比例取培养过夜的菌液，接种到预热至37℃并含适当抗生素的LB培养液中。例如取5ml培养过夜的菌液接种到100ml预热至37℃并含适当抗生素的LB培养液中。具体的培养体积视需要纯化的蛋白量而定，初步的鉴定培养3-10ml即可；常规的表达纯化，通常可考虑培养100-200ml；制备型的纯化，培养体积可以达到1L或更大。如果希望取得更好的表达效果，建议按照1:100的比例接种过夜培养的菌液，但后续培养至相应的OD值需要更长的时间。
c.37℃常规培养约30-60min或更长时间，至菌液的OD600达到0.5-0.7，并且OD600最好接近0.6。
d.加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养4-5小时。
注：可以在加入IPTG前取出少量菌液同样培养4-5小时后作为未诱导的对照，也可以在加入IPTG前直接取出少量菌液作为未诱导的对照。对于特定蛋白的诱导表达，最佳的IPTG浓度、诱导温度、和诱导时间需要通过实验确定。
e.收集菌液至离心管中，4℃ 4,000g离心20min或4℃ 15,000g离心1min，弃上清，收集沉淀。随后即可进入细菌裂解步骤，也可以在-20℃或-80℃冻存备用。冷冻保存的菌体使用前需置于冰上解冻15min。
2.非变性条件下His标签蛋白的小量纯化：
本方法常用于小量样品的快速分析和鉴定，为后续大量制备打下基础。
a.接步骤1(e)，离心收集1ml菌液的细菌沉淀并弃上清，加入100µl非变性裂解液，将细菌沉淀充分重悬于裂解液中，可进行轻微的vortex(尽量避免产生气泡)。
注：根据His标签重组蛋白表达的丰度，菌液和裂解液的体积比可以在25:1-5:1范围内适当调整。表达丰度非常高时，每毫升菌液沉淀可以加入200µl裂解液；表达丰度非常低时，每毫升菌液沉淀可以加入40µl裂解液。相关溶液的配制方法附后。本非变性裂解液可以确保裂解绝大多数可溶性蛋白和包涵体蛋白，裂解后可以直接用于SDS-PAGE。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如碧云天的P1030/P1031 蛋白酶抑制剂混合物(His-Tag蛋白纯化用, 100X)。
b.加入溶菌酶至1mg/ml并轻轻混匀，尽量避免产生气泡，冰水浴或冰上放置30min。
注：如果没有溶菌酶，也可以直接冰上超声裂解细菌，随后进入步骤2d。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。
c.轻轻vortex数下，以充分裂解细菌，尽量避免产生气泡。
d.4℃离心(15000g×10min)，取10µl上清留样作后续检测用，收集余下上清至一新的洁净离心管中。
e.加入20µl混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)，4℃在摇床上缓慢摇动30min，以充分结合带His标签的目的蛋白。
注：缓慢摇动30min已经可以确保蛋白充分结合，但可以根据时间安排的需要缓慢摇动更长时间甚至缓慢摇动过夜。经测试，直接使用50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)也能获得良好的纯化效果。但如果希望获得更高的标签蛋白得率，可以事先用一个柱体积的非变性裂解液平衡BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型) 2-3次。平衡后，视不同的待纯化蛋白而定，待纯化蛋白的得率有可能会提高约5-20%左右。
f.4℃离心(1000g×10s)沉淀凝胶，取20µl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。
g.加入100µl非变性洗涤液重悬凝胶，4℃离心(1000g×10s)，取20µl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。
h.重复步骤g，再进行一次洗涤。
i.加入20µl非变性洗脱液，轻轻重悬凝胶。4℃离心(1000g×10s)，收集上清及凝胶。上清即为纯化获得的带有His标签的目的蛋白。
j.重复步骤i两次。共洗脱收集约60µl纯化的蛋白样品。
3.非变性条件下His标签蛋白的大量纯化：
a.接步骤1(e)，对于新鲜的或解冻的细菌沉淀，按照每升(指步骤1中培养时的体积)表达菌中加入80ml非变性裂解液的比例加入裂解液，充分重悬菌体。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如碧云天的P1030/P1031 蛋白酶抑制剂混合物(His-Tag蛋白纯化用, 100X)。
b.加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。
注：如果没有溶菌酶，也可以直接进入步骤3c。
c.冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。如果未经溶菌酶处理，推荐每次超声处理2s，每次间隔2s，共超声处理15-30min。
注：具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。
d.(可选做)如果超声处理后裂解液非常粘稠，可以加入RNase A至10µg/ml及DNase I至5µg/ml，冰上放置10-15min。或者也可以使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次，以剪切粘稠的基因组DNA等。
e.4℃ 10,000g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20µl上清留作后续检测用。
注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。
f.按照每4ml细菌裂解液上清加入1ml混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)的比例(4:1)，混合细菌裂解液上清和50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)。4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min。
g.将裂解液和BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)的混合物装入适当的空柱管中，如碧云天的亲和层析柱空柱管。
注：也可先装柱，用1倍柱体积的非变性裂解液平衡后加入细菌裂解液上清，后续可以把穿流液收集后重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白。先混合后装柱的方式操作起来相对麻烦一些，但更有利于带有His标签重组蛋白与镍柱的充分结合，特别是当His标签被蛋白本身部分遮挡或His标签重组蛋白浓度很低时与镍柱的结合效率会高一些。
h.将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20µl穿流液作后续分析用。
i.洗柱5次，每次加入1-2个柱体积的非变性洗涤液，每次均收集约20μl穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。例如1ml混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)装柱后的柱体积为0.5ml，即1ml混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)装柱后每次洗柱的洗涤液体积为0.5ml。洗柱及下一步洗脱过程中可以用Bradford法(P0006)简单快速地检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。
注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗柱次数2-3次，或者在非变性洗涤液洗涤之前用非变性裂解液洗柱3-5次，每次1-2个柱体积。
j.洗脱目的蛋白5-10次，每次用一个柱体积的非变性洗脱液。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。蛋白纯化效果可以参考图1。

图1. 非变性条件下His标签重组蛋白纯化效果图。M: marker (P0076); CL：细菌裂解液(cell lysate)；FT：上样穿流液(flow through)；W1-W3：非变性裂解液洗涤1-3 (wash 1-3)；W4-W8：非变性洗涤液(非变性裂解液添加20mM咪唑)洗涤4-8；E1-E4：洗脱液(非变性裂解液添加250mM咪唑)洗脱1-4 (elution 1-4)。注：实际的电泳结果会因样品、上样量等的不同而有所不同。

4.变性条件下His标签蛋白的小量纯化：
本方法常用于小量样品的快速分析和鉴定，为后续大量制备打下基础。
a.接步骤1(e)，离心收集1ml菌液的细菌沉淀并弃上清，加入100μl变性裂解液，将细菌沉淀充分重悬于裂解液中，可进行轻微的vortex(尽量避免产生气泡)。
注：根据His标签重组蛋白表达的丰度，菌液和裂解液的体积比可以在25:1-5:1范围内适当调整。表达丰度非常高时，每毫升菌液沉淀可以加入200μl裂解液；表达丰度非常低时，每毫升菌液沉淀可以加入40μl裂解液。相关溶液的配制方法附后。本变性裂解液可以确保裂解绝大多数可溶性蛋白和包涵体蛋白，含尿素裂解液裂解后可以直接用于SDS-PAGE，含盐酸胍的裂解液裂解后需透析除去盐酸胍才可用于SDS-PAGE。
b.冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。
c.4℃离心(15000g×10min)，取10μl上清留样作后续检测用，收集余下上清至一新的洁净离心管中。
d.加入20μl混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)，4℃在摇床上缓慢摇动30min，以充分结合带His标签的目的蛋白。
注：缓慢摇动30min已经可以确保蛋白充分结合，但可以根据时间安排的需要缓慢摇动更长时间甚至缓慢摇动过夜。经测试，直接使用50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)也能获得良好的纯化效果。但如果希望获得更高的标签蛋白得率，可以事先用一个柱体积的变性裂解液平衡BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)2-3次。平衡后，视不同的待纯化蛋白而定，待纯化蛋白的得率有可能会提高约5-20%左右。
e.4℃离心(1000g×10s)沉淀凝胶，取20μl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。
f.加入50-100μl变性裂解液重悬凝胶，4℃离心(1000g×10s)，取20μl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。
g.重复步骤f，再进行一次洗涤。
h.加入20μl变性洗脱液，轻轻重悬凝胶。4℃离心(1000g×10s)，收集上清及凝胶。上清即为纯化的带有His标签的目的蛋白。
i.重复步骤h两次。共洗脱收集约60μl纯化的蛋白样品。
5.变性条件下His标签蛋白的大量纯化：
接步骤1(e)，对于新鲜的或解冻的细菌沉淀，按照每1L表达菌加入80ml变性裂解液的比例加入裂解液，充分重悬菌体。
a.冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理2s，每次间隔2s，共超声处理15-30min。
注：具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。
b.(可选做)如果超声处理后裂解液非常粘稠，可以使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次，以剪切粘稠的基因组DNA等。
c.4℃ 10,000g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20μl上清留作后续检测用。
注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。
d.取适量混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入一个柱体积的变性裂解液混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，再重复平衡1-2次，弃去液体。
e.按照每0.5ml凝胶(相当于1ml 50%的凝胶)中加入4ml细菌裂解液上清的比例(1:8)，混合BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)和细菌裂解液上清。4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min。
f.将裂解液和BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)的混合物装入适当的空柱管中，如碧云天的亲和层析柱空柱管。
注：也可先装柱，用1倍柱体积的变性裂解液平衡后加入细菌裂解液上清，后续可以把穿流液收集后重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白。先混合后装柱的方式操作起来相对麻烦一些，但更有利于带有His标签重组蛋白与镍柱的充分结合。
g.将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20µl穿流液作后续分析用。
h.洗柱5次，每次加入1-2个柱体积的变性裂解液，每次均收集约20μl穿柱的裂解液用于后续的分析检测用。例如1ml混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)装柱后的柱体积为0.5ml，即1ml混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)装柱后每次洗柱的裂解液体积为0.5-1ml。洗柱及下一步洗脱过程中可以用Bradford法(P0006)简单快速地检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。
注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗柱次数2-3次。
i.再次洗柱5次，每次加入1-2个柱体积的变性洗涤液，每次均收集约20μl穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。
注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗柱次数2-3次。
j.洗脱目的蛋白5-10次，每次用一个柱体积的变性洗脱液。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。蛋白纯化效果可以参考图2及图3。

图2. 8M尿素变性条件下His标签重组蛋白纯化效果图(所用溶液均含有8M尿素)。M：marker (碧云天P0076)；CL：细菌裂解液(cell lysate)；FT：上样穿流液(flow through)；W1-W3：变性裂解液洗涤1-3；W4-W8：变性洗涤液(变性裂解液添加20mM咪唑)洗涤；E1-E4：洗脱液1-4 (变性裂解液添加250mM咪唑)。注：实际的电泳结果会因样品、上样量等的不同而有所不同。

图3. 6M盐酸胍变性条件下His标签重组蛋白纯化效果图(所用溶液均含有6M盐酸胍，各样品电泳前通过透析除去盐酸胍)。M：marker (碧云天P0076)；CL：细菌裂解液(cell lysate)；FT：上样穿流液(flow through)；W1-W3：变性裂解液洗涤1-3；W4-W8：变性洗涤液(变性裂解液添加20mM咪唑)洗涤；E1-E4：变性洗脱液1-4 (变性裂解液添加250mM咪唑)。注：实际的电泳结果会因样品、上样量等的不同而有所不同。

6.简化的操作流程：
a.细菌中的目的蛋白诱导表达后，离心沉淀细菌。
b.按照每克细菌沉淀湿重加入2-5ml裂解液的比例加入裂解液，可添加适量蛋白酶抑制剂(如碧云天的P1030/P1031)，充分重悬细菌。
注：裂解液中咪唑浓度不宜超过20mM，通常0-10mM即可。本产品兼容Tris裂解液体系(参见后附的相关溶液配制方法)及NaH₂PO₄裂解液体系(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, pH 8.0)。
c.超声或其它适当方法裂解细菌，离心取上清。
d.BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)装柱，1倍柱体积裂解液平衡纯化柱2-3次。
e.步骤6c中的上清上柱。
注：上清上柱是可以收集穿流液并重复上柱3-5次，以充分结合His标签蛋白。
f.用一倍柱体积的洗涤液洗柱5次。
注：洗涤液中咪唑浓度不宜超过20mM，通常10-20mM即可，首次实验推荐使用含20mM咪唑的洗涤液。如果发现效果欠佳，可以根据实际情况上调或下调咪唑的浓度。如果洗脱不干净，可以增加洗涤次数或者增加洗涤液中的咪唑浓度。
g.用一倍柱体积的洗脱液洗脱5-10次。
7.BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)的再生
使用过的BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)可以通过如下方法再生后继续使用。但再生的BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)通常宜仅用于相同蛋白的纯化，并且最多再生3-4次。一次或多次再生后，BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)的蛋白结合能力会有所下降，并且非特异性结合也会升高。
如有需要，可以参考如下步骤进行镍柱的再生：
a.加入5倍柱体积的去离子水洗柱一次。
b.加入1倍柱体积的25%、50%、75%乙醇各洗柱一次。
c.加入5倍柱体积的100%乙醇洗柱一次。
d.加入1倍柱体积的75%、50%、25%乙醇各洗柱一次。
e.加入2倍柱体积的去离子水洗柱一次。
f.加入2倍柱体积的200mM EDTA (pH 8.0)，洗柱一次。
g.加入5倍柱体积的去离子水洗柱一次。
h.加入3倍柱体积的50mM NiSO4洗柱一次。
i.加入3倍柱体积的非变性裂解液洗柱一次。
j.加入3倍柱体积的去离子水洗柱一次。
k.随后把BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)存放在20%乙醇中，4ºC保存，后续即可用于相同蛋白的纯化。
常见问题：
如果纯化不成功，可以对纯化过程中收集的每个组分进行SDS-PAGE电泳检测，分析其原因。
1.蛋白无法与BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)结合
a.测序检查基因序列的读码框是否正确。
b.尝试将标签加在蛋白的另一端。
c.增加BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)与蛋白结合时间(如4℃过夜)。
d.如果使用预装柱，可收集裂解液上柱后的穿流液并多次重复上柱。
e.检查所有缓冲液和溶液的pH值是否正确。
f.确认体系中所用各种试剂的浓度在镍柱的耐受范围以内。
g.自行配制裂解液，降低裂解液中的咪唑浓度。
2.目的蛋白被洗涤液洗脱
a.自行配制洗涤液，降低洗涤液中的咪唑浓度或者稍微提高其pH值。
b.检查洗涤液的pH和成分。
c.确认洗涤液中各种试剂的浓度在耐受范围内。
3.蛋白在纯化过程中形成沉淀
a.将纯化温度控制在室温。
b.加入去垢剂，如0.1% Triton X-100或者Tween-20。
4.蛋白无法洗脱
a.用梯度pH及咪唑洗脱，确定最优洗脱条件。
5.目的蛋白与其它蛋白共同洗脱
a.提高裂解液和洗涤液中的咪唑浓度。
b.降低BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)的使用量。
c.增加盐或者去垢剂浓度，或者向洗涤液中加入乙醇或甘油以降低非特异相互作用。
d.检查基因内部是否含有起始密码子(C端标记蛋白)或者提前终止位点(N端标记蛋白)。
相关溶液配制方法：

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