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| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 产品价格 |
| PP778 | Mouse PD-1 ELISA Kit | 96次 | 3198.00元 |
碧云天的Mouse PD-1 ELISA Kit (Mouse Programmed Death-1 receptor Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即小鼠程序性死亡分子1酶联免疫吸附检测试剂盒，是一种用于特异性地高灵敏地定量检测小鼠血清、血浆或细胞培养上清液中的PD-1的ELISA试剂盒。
本产品检测灵敏度高，特异性强，重复性好。多次重复检测结果表明，最小检出量为55pg/ml，与小鼠B7-H1、PD-L2，人PD-1/Fc Chimera等均没有交叉反应，板内、板间变异系数均小于10%。
程序性死亡分子(programmed death-1 receptor, PD-1)，又称CD279，是一种I型跨膜蛋白，属于免疫调节受体中的CD28家族。该家族中其它成员还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。成熟的小鼠PD-1包括149氨基酸长度的胞外域(ECD)、21个氨基酸长度的跨膜域和98个氨基酸长度的胞质域，其中胞外域中包括一个免疫球蛋白样V型区域。小鼠PD-1的胞外域与人PD-1胞外域具有65%的氨基酸同源性。胞质域中包含两个酪氨酸残基，这两个酪氨酸残基能够形成免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM)，二者对于调节PD-1信号传递十分重要。PD-1主要表达在活化的T细胞、B细胞、单核细胞和树突状细胞，与相应配体PD-L1 (B7-H1)或PD-L2 (B7-DC)按1:1的比例相互作用。二者结合后会促进T细胞的凋亡和功能丧失，因此PD-1和PD-L1的相互作用是调节免疫应答和免疫耐受的重要环节。通过相应抗体封闭或遗传学基因改变阻止二者的相互作用能够有效改善肿瘤免疫治疗效果。
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法(Sandwich ELISA)检测样品中小鼠PD-1的浓度，其原理见图1。小鼠PD-1特异的单克隆捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标准品或样品时，其中的小鼠PD-1会与捕获抗体结合。当加入生物素化的抗小鼠PD-1抗体后，生物素化抗小鼠PD-1抗体与小鼠PD-1结合，形成夹心的免疫复合物。随后加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin (HRP-Streptavidin)，由于生物素与链霉亲和素(Streptavidin)可以特异性地结合，因此链霉亲和素连接的HRP就会与夹心的免疫复合物连接起来而被固相捕获。最后加入显色剂TMB溶液，固相捕获的辣根过氧化物酶就会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测450nm处的吸光度值就能实现定量检测。小鼠PD-1浓度与A450值呈正比，通过绘制标准曲线，对照样品吸光度值，即可计算出样品中小鼠PD-1浓度。
图1. 双抗体夹心ELISA原理图。
一个包装的本试剂盒，包括标准品检测，可以进行96次检测。
包装清单：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| PP778-1 | 小鼠PD-1抗体预包被板 | 8孔×12条 |
| PP778-2 | 样品分析缓冲液 | 5ml |
| PP778-3 | 标准品稀释液 | 10ml |
| PP778-4 | 小鼠PD-1标准品 | 2-4瓶 |
| PP778-5 | 小鼠PD-1生物素化抗体 | 10ml |
| PP778-6 | 辣根过氧化物酶标记Streptavidin | 10ml |
| PP778-7 | 洗涤液(20X) | 30ml |
| PP778-8 | TMB溶液 | 10ml |
| PP778-9 | 终止液 | 5ml |
| PP778-10 | 封板膜(透明) | 2张 |
| PP778-11 | 封板膜(白色) | 2张 |
| - | 说明书 | 1份 |
使用说明：
1.样品准备
a. 样品的准备请按下列流程进行操作：
(a)细胞上清样品离心取上清即可(如100-500g，5分钟)。
(b)对于血清样品，将全血在室温下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀。制备好的血清需置于冰上待用。
(c)对于血浆样品，采集的全血建议使用EDTA进行抗凝处理，混匀后置冰上，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。制备好的血浆需置于冰上待用。
(d)若待测样品不能及时检测，样品制备后请分装，冻存于-20℃或-80℃，并注意避免反复冻融。
b.血清样品不应添加任何防腐剂或抗凝剂。
c.样品应清澈透明，检测前样品中如有悬浮物应通过离心去除。
d.请勿使用溶血、高血脂或污染的样品检测，否则结果将不准确。
注：血清或血浆样品可能需要用样品分析缓冲液倍比稀释后再检测。
2.检测前准备工作
a.试剂盒从冰箱中取出后应置室温(25-28℃)平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时置于4℃保存。
b.配制适当量的洗涤液：将洗涤液(20X)用双蒸水或去离子水稀释至1X，例如10ml洗涤液(20X)加190ml水混匀后即为1X的洗涤液。
c.按标准品标签上标注的体积加入标准品稀释液至1瓶标准品中，室温孵育15分钟(为确保标准曲线的准确性，切勿缩短孵育时间)。随后轻轻混匀并用移液枪吹打几次使标准品彻底溶解，使标准品终浓度达到8000pg/ml。通常每个浓度的标准品需要检测2个孔，每个孔的标准品用量为100μl，共需200μl，同时稀释时还需要使用250μl，因此如果1瓶标准品配制后的体积不足0.45ml，请使用更多瓶数的标准品，并在合并混匀后使用。
d.取5个洁净的1.5毫升离心管，每管预先加入250μl的标准品稀释液，并参考图2进行标准品的倍比稀释，最终得到8000、4000、2000、1000、500、250pg/ml共六个标准品浓度，最后将稀释好的标准品依次加入预包被板孔中，标准品稀释液直接加入作为0pg/ml浓度，共七个标准品浓度。
图2. 标准品倍比稀释示意图。按标准品(STANDARD)标签上标注体积加入标准品稀释液溶解并混匀后的浓度为标准品的起始浓度。其它的倍比稀释后的浓度依次为起始浓度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。
3.洗涤方法
自动洗板机或手工洗板：每孔洗涤液为300μl，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣在厚吸水纸上适当用力拍干。
4.实验过程需自备的材料和仪器
a.不同规格的移液枪及相应的吸头
b.酶标仪
c.自动洗板机(如果没有也可以手工洗板)
d.去离子水或双蒸水
5.操作步骤
a.计算并确定一次实验所需的预包被板条数，取出所需板条放置在96孔框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。
b.每次实验都需配制标准品并绘制出标准曲线，同时建议设置本底较正孔，即空白孔，设置方法为该孔只加TMB溶液和终止液。
c.分别将样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育120分钟。对于细胞裂解液样品的PD-1的检测，请加入50μl样品分析缓冲液后再加50μl样品(注：此处样品相当于已经被稀释了2倍)，如果样品浓度过高，超出检测范围，请先加入50μl样品分析缓冲液，再加入50μl稀释后的样品。对于细胞上清样品，请直接加入。对于血清或血浆样品，由于其中PD-1含量极低，建议先进行预实验，确认样品中PD-1浓度，加样方法与细胞裂解液样品相同。请注意记录好样品的稀释倍数。
注意：请先查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，如果该浓度大于或者小于本试剂盒的最高或者最低标准品浓度，请适当稀释或浓缩后再进行检测。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
d.加入生物素化抗体100μl/孔(注：此生物素化抗体已经预先配制好，可以直接使用，不必再进行稀释)。用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育60分钟。
e.洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
f.加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin 100μl/孔(注：此辣根过氧化物酶标记Streptavidin已经预先配制好，可以直接使用，不必再进行稀释)。用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育20分钟。室温偏低时(低于25ºC)，需要适当延长孵育时间。
g.洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
h.加入显色剂TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育15-20分钟。室温偏低时需要适当延长孵育时间，此时可以孵育至标准品出现非常显著的颜色变化，若样品浓度足够高也会出现显著的颜色变化。
i.加入终止液50μl/孔，混匀后立即测量A450值。
6.结果分析
a.复孔的值通常在20%的差异范围内结果才有效，复孔平均值可作为测量值。
b.每个标准品或样品的吸光度值应减去本底校正孔的吸光度值(如果没有做校正孔，则不需要减去)。
c.绘制标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。
图3. Mouse PD-1 ELISA Kit的标准曲线。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
d.若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重新测定，计算浓度时需注意乘以样品的稀释倍数。
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