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核酸相关> RNA相关> RNA提取
BeyoMag™磁珠法血液mRNA抽提试剂盒
产品编号: R0095L
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价格: ¥ 3518.00
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
R0095S BeyoMag™磁珠法血液mRNA抽提试剂盒 50次 328.00元
R0095M BeyoMag™磁珠法血液mRNA抽提试剂盒 200次 1098.00元
R0095L BeyoMag™磁珠法血液mRNA抽提试剂盒 800次 3518.00元

碧云天的BeyoMag™磁珠法血液mRNA抽提试剂盒(BeyoMag™ Animal mRNA Isolation Kit with Magnetic Beads)是一种使用Oligo (dT)25包被的磁珠,配合优化的缓冲体系,用于稳定、高效、便捷地从新鲜、冻存、经EDTA、肝素等抗凝处理或经过RNALater™血液RNA稳定保存液(R0116)保存的血液中快速分离纯化出高纯度完整mRNA的试剂盒。

本试剂盒抽提的mRNA可直接应用于RT-PCR、qPCR、高通量测序、mRNA文库的构建、固相cDNA文库构建、Northern blot分析、RACE等分子生物学实验,还可用于mRNA疫苗的研发等[1-2]。

一个典型的哺乳血液细胞中,四种主要的大分子的质量和占比为:RNA, ∼20pg (1%); DNA, ~7pg (0.3%); protein, ∼500pg (20%); polysaccharide (多糖), ∼2μg (78.7%)。信使RNA (messenger RNA, 简称mRNA)约占总RNA质量的4%,核糖体RNA (ribosomal RNA, 简称rRNA)约占80% [3]。

本试剂盒的原理和主要操作流程如图1所示。BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠表面共价修饰了25聚dT序列即Oligo (dT)25,当血液的裂解液与BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠混合后,磁珠表面的寡聚dT序列与mRNA 3'端的poly(A)进行碱基配对而特异性结合,然后在外界磁场的作用下,磁珠与相应溶液可以快速而高效地分离,经洗涤充分去除杂质,最后用洗脱液将mRNA从磁珠上洗脱下来,即可获得高纯度完整mRNA [4-5]。

图1. BeyoMag™磁珠法血液mRNA抽提试剂盒(R0095)的工作原理示意图。

本试剂盒具有提取效果稳定、纯度高、速度快、操作便捷等优点。本试剂盒的mRNA提取体系经过反复测试和优化,能从100µl新鲜小鼠血液抽提约0.1-1µg mRNA。仅需孵育、洗涤、洗脱等简单的操作,整个纯化过程不超过15分钟即可完成。所有操作都在同一个离心管中完成,操作便捷。本试剂盒及国内同类产品Competitor C抽提小鼠新鲜血液的mRNA的检测效果比较参见图2。

图2. BeyoMag™磁珠法血液mRNA抽提试剂盒(R0095)用于从新鲜小鼠血液中抽提mRNA的效果图。使用本试剂盒及国内同类产品Competitor C抽提小鼠新鲜血液的mRNA,然后使用BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X) (with gDNA EZeraser) (D7185)进行cDNA合成,随后使用BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, Low ROX)(D7262)和Actin、B2M和GAPDH三种内参引物进行qPCR检测,图中可见使用本试剂盒与同类产品抽提的mRNA,qPCR检测的Ct值基本一致。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本试剂盒中的BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠粒径约为200nm,浓度约为5mg/ml。每毫克磁珠偶联的Oligo (dT)25约为300-400pmol,每毫克磁珠可纯化约2-3µg mRNA。

对于常规的mRNA抽提,按照每个样品使用20μl磁珠悬浊液,本试剂盒小包装可用于50次mRNA抽提,中包装可用于200次mRNA抽提,大包装可用于800次mRNA抽提。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R0095S-1 BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠 1ml
R0095S-2 溶液I (结合液) 30ml
R0095S-3 溶液Ⅱ (裂解液) 30ml
R0095S-4 溶液Ⅲ(洗涤液I) 30ml
R0095S-5 溶液Ⅳ(洗涤液Ⅱ) 60ml
R0095S-6 溶液Ⅴ(洗脱液) 5ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R0095M-1 BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠 4ml
R0095M-2 溶液I (结合液) 120ml
R0095M-3 溶液Ⅱ (裂解液) 120ml
R0095M-4 溶液Ⅲ(洗涤液I) 120ml
R0095M-5 溶液Ⅳ(洗涤液Ⅱ) 240ml
R0095M-6 溶液Ⅴ(洗脱液) 20ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R0095L-1 BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠 16ml
R0095L-2 溶液I (结合液) 480ml
R0095L-3 溶液Ⅱ (裂解液) 480ml
R0095L-4 溶液Ⅲ(洗涤液I) 480ml
R0095L-5 溶液Ⅳ(洗涤液Ⅱ) 480ml×2
R0095L-6 溶液Ⅴ(洗脱液) 80ml
说明书 1份
保存条件:

4ºC保存,一年有效。其中BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠长期不使用时,可以-20ºC保存,-20ºC可以保存更长时间。

注意事项:

血液样品推荐使用碧云天生产的RNALater™血液RNA稳定保存液(R0116)进行保存以保持RNA的完整性。

操作过程要严格保证无RNA酶和DNA酶污染。对于操作环境中RNase的去除,推荐使用碧云天生产的RNase and DNase Away (R0123)以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。

本产品的所用试剂和耗材都要求是RNase-free和DNase-free的,操作时应小心,避免被污染。如果耗材可能有RNase污染,可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜,然后高温高压灭菌并烘干。如果可能有DNase污染,通常高温高压灭菌可以使DNase灭活。

需自备磁分离装置,推荐使用碧云天的BeyoMag™磁分离架系列产品(FMS004FMS008FMS012FMS016FMS024)。

温度较低时,溶液II (裂解液)可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀,可置于室温或者37ºC水浴溶解,混匀后使用。

分装或使用磁珠时,请适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。

磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象,可以在磁珠聚集后晃动管内液体,使挂壁的磁珠流下。

请使用推荐的血液量,否则可能造成磁珠聚集,会影响洗涤进而影响抽提获得的mRNA纯度。发生磁珠聚集时,洗涤时需尽量分散磁珠,这样可有效改善提取效果。如果发生磁珠聚集现象,建议在后续实验中适当减少总细胞量和总组织量。

由于mRNA容易降解,提取获得的mRNA推荐尽快用于RT-PCR等后续实验。如果不能尽快使用,需要-80ºC保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 准备工作。
a. 溶液I (结合液)、溶液II (裂解液)、溶液Ⅲ (洗涤液I)和溶液Ⅳ(洗涤液Ⅱ)使用前平衡至室温。溶液Ⅴ(洗脱液)在使用前置于冰上或者2-8ºC保存。如果溶液有沉淀,适当水浴或者振荡溶解。
b. 血液的准备。
(a) 收集50-100µl新鲜的红细胞无细胞核的血液样品,或5-10µl红细胞有细胞核的血液,加入含抗凝剂的抗凝管中,颠倒混匀。
注1:人、猴、牛、兔、大鼠、小鼠等的红细胞无细胞核,鸟、鱼、蛙等的红细胞有细胞核。红细胞有细胞核会导致相同体积的血液内RNA的含量非常高。抗凝剂推荐使用EDTA钠盐或钾盐,肝素和柠檬酸盐也可以。
注2:白细胞的收集和保存在RNALater™血液RNA稳定保存液(R0116)中的血液样品,请参考RNALater™血液RNA稳定保存液的使用说明步骤1、2对血液样品进行处理。对于白细胞,由于不含红细胞,对于“红细胞有细胞核的血液”的血液体积可参考“红细胞无细胞核的血液样品”。
(b) 按照血液量加入下表中推荐的溶液II (裂解液/Lysis Buffer)。通过移液器吹打多次,裂解细胞至溶液变粘稠。
(c) 选做:加入溶液Ⅱ (裂解液)后样品可能会比较粘稠,可适当超声或使用1ml注射器反复抽吸打断基因组DNA从而使粘稠感消失。此操作会产生泡沫,但不影响mRNA的得率。
(d) 4ºC以14,000×g离心5分钟,并将上清转移至一个新的离心管。上清可用于mRNA纯化,或保存在-80ºC备用。
c. BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠的准备。
(a) 将磁珠溶液从4ºC冰箱取出,适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。参考下表,根据总细胞量或组织重量和样品数量,取适量的BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠悬液至一洁净离心管中。推荐使用BeyoGold™ 1.5毫升离心管(无色, Nuclease free) (FTUB306)。
Blood Volume Lysis Buffer Beads Wash Solution I Wash Solution Ⅱ
<50µl 100µl 20µl 500µl 500µl each time
50~100µl 300µl 40µl 500µl 500µl each time
100~300µl 600µl 100µl 500µl 500µl each time
(b) 无论磁珠用量多少,按照每个样品200µl溶液I (结合液)的量,加入适量溶液I (结合液)洗涤磁珠,用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离30秒,去除上清。重复本步骤1次。说明:如果样品数量超过5个,可以考虑将适量磁珠悬液先直接置于磁 力架上分离30秒,去除上清,然后根据样品数量再加入适量溶液I (结合液)洗涤2次。
(c) 按照每个样品100µl溶液I (结合液)的量,加入适量溶液I (结合液)重悬磁珠。
2. 从血液中抽提mRNA。
a. 取上述制备好的血液样品与100µl洗涤后的磁珠在室温下旋转混合5分钟 。
b. 置于磁力架上分离1分钟,去除上清。
c. 室温下用500µl溶液Ⅲ(洗涤液I/Wash Solution I)洗涤磁珠,磁分离30秒,去上清。
注意:该步骤可能会出现絮凝物,增加洗涤次数,可使磁珠分散均匀,絮凝减少,絮凝不影响mRNA的抽提。
d. 室温下用500µl溶液Ⅳ(洗涤液Ⅱ/Wash Solution Ⅱ)洗涤磁珠,磁分离30秒,去上清。重复本步骤1次。
e. 根据后续实验需求,进行mRNA的洗脱:
(a) 从磁珠上洗脱mRNA:加入10-20µl溶液Ⅴ(洗脱液)或Nuclease-free的水,如DEPC水(R0021/R0022)或BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876),75-80ºC孵育2分钟,磁分离30秒,然后将上清转移到新的Nulcease-free的离心管中,置于冰上待用。
注:建议转移上清时保留少量液体以免吸到磁珠影响后续实验。纯化获得的mRNA极易降解,建议尽快进行后续实验。短时间内不使用,请置于-80ºC保存。
(b) 如果mRNA不洗脱直接用于后续实验,如固相cDNA文库构建等,用500µl溶液Ⅳ(洗涤液Ⅱ)洗涤一次,再用后续实验中相应的缓冲液再洗涤一次,即可用于后续实验。
参考文献:
1. Wommer L, Soerjawinata W, Ulber R, Kampeis P. Eng Life Sci. 2021. 21(10): 558–572.
2. Chaudhary N, Weissman D & Whitehead K A. Nat Rev Drug Discov. 2021.20, 817–838.
3. Wu J, Xiao J, Zhang Z, Wang X, Hu S, Yu J. Genomics Proteom Bioinforma. 2014. 12(2):57-63.
4. Michael R Green, Joseph Sambrook. Cold Spring Harb Protoc. 2019.10:711-714.
5. Nicholas M. Adams, Hali Bordelon, et al. ACS Applied Materials & Interfaces. 2015. 7(11):6062-6069.
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