使用说明：
1.样品制备：
a.细胞样品
(a)细胞培养：细胞培养至12孔板、6孔板或盖玻片上(可以酌情使用多聚赖氨酸进行预处理)，待细胞密度达到70-90%时，用PBS洗涤细胞2-3次。注：对于很多细胞，使用多聚赖氨酸预处理可以有效防止后续的检测过程中细胞发生脱落。
(b)固定：加入4%多聚甲醛固定液(P0099)室温固定10分钟。大多数细胞固定10分钟即可，最佳固定时间可适当调整。
(c)洗涤：去除固定液，用PBS (DNase/RNase free)室温摇床缓慢摇动洗涤3次，每次5分钟。
注1：如果细胞容易脱落，也可以不进行摇动，可酌情延长洗涤时间或增加洗涤次数。后续所有的细胞或切片的洗涤如果容易脱落，也都可以不进行摇动，并都可以酌情延长洗涤时间或增加洗涤次数。
注2：后续使用的PBS均须为DNase/RNase free。
b.冰冻切片
(a)新鲜组织用4%多聚甲醛固定液(P0099)固定，固定时间根据组织大小而定，建议1-2小时。切片厚度5-10μm左右，烘干。
(b)洗涤：用PBS室温摇床洗涤3次，每次5分钟。
c.石蜡切片
(a)制片：新鲜组织用4%多聚甲醛固定液(P0099)固定。固定时间根据组织大小而定，建议1-2小时。切片厚度最好不超过4μm，烘干。
(b)脱蜡：二甲苯洗涤2次，每次3分钟，再用二甲苯/乙醇(1:1)溶液洗涤3分钟。
(c)复水：依次用100%、100%、95%、70%、50%乙醇洗涤，各洗涤3分钟，再用超纯水(DNase/RNase free)洗涤2次，每次5分钟。
2.细胞通透：
a.通透：加入适量5-20μg/ml Proteinase K (用PBS配制)，室温消化2-10分钟。
注1：最佳的Proteinase K浓度和时间取决于细胞组织类型和切片厚度，建议尝试Proteinase K浓度梯度来确定最佳条件。
注2：如果通透效果不够理想，可以在Proteinase K消化结束后，尝试增加含0.5% Triton X-100的PBS室温摇床洗涤样品5分钟。
b.洗涤：用PBS摇床洗涤2次，每次5分钟。
c.固定：用4%多聚甲醛固定液(P0099)室温固定10分钟。
d.洗涤：去除固定液，用PBS摇床洗涤2次，每次5分钟。
3.降低背景：
a.中和碱性蛋白：加入适量0.5M HCl浸没细胞，室温摇床洗涤5分钟。
b.洗涤：用PBS摇床洗涤2次，每次5分钟。
c.乙酰化作用：将Acetylation Solution A 和Acetylation Solution B按照1:400的比例混合均匀，配制成Acetylation Solution。加入适量Acetylation Solution浸没样品，室温摇床洗涤10分钟。
注：Acetylation Solution须现配现用。
d.洗涤：用PBS摇床洗涤2次，每次5分钟。
4.杂交：
a.试剂配制(RNase free操作)
(a)含探针的杂交液：取适量Hybridization Solution，按照1:100加入Yeast RNA (100X)并混匀，加入探针至最终浓度为0.5-1μg/ml，尽量避光配制。
注1：探针的浓度可根据实际情况进行适当优化。
注2：Yeast RNA (100X)通常可以加入以降低背景，但如果会导致产生非特异性杂交信号可以选择不加入。
(b)Wash Buffer I：用超纯水(DNase/RNase free)将Wash Buffer (20X)稀释至4X，再将Formamide deionized与4X Wash Buffer按照1:1混合均匀。
注：使用时须提前预热至杂交温度。
(c)Wash Buffer II：用超纯水(DNase/RNase free)将Wash Buffer (20X)稀释至2X，混匀。
注：使用时须提前预热至杂交温度。
(d)Wash Buffer III：用超纯水(DNase/RNase free)将Wash Buffer (20X)稀释至1X，混匀。
注：使用时须提前预热至杂交温度。
(e)Wash Buffer Ⅳ：用超纯水(DNase/RNase free)将Wash Buffer (20X)稀释至0.1X，混匀。
注：使用时须提前预热至杂交温度。
b.预杂交：加入适量含Yeast RNA (1X)的Hybridization Solution浸没细胞，样本密封，防止蒸发，放置24-65ºC避光摇床孵育20分钟。
注1：探针预杂交温度低于探针Tm值22-25ºC。
注2：后续的探针预处理、杂交、洗涤的温度都和预杂交的温度保持一致。
注3：通常推荐使用含Yeast RNA (1X)的Hybridization Solution进行预杂交以降低背景，但如果后续会导致产生非特异性杂交信号可以选择不加入。
c.探针预处理：将含探针的杂交液放置24-65ºC避光摇晃20分钟后，立刻冰浴2分钟，适当混匀后冰浴放置备用。
d.杂交：去除Hybridization Solution，滴加含探针的杂交液浸没样本，密封后放置24-65ºC避光摇床杂交2-12小时。
注：较短探针(约20nt)杂交2-3小时即可，探针较长(约500nt)杂交时间可适当延长。
e.探针回收：将含探针的杂交液回收至洁净离心管中， -20ºC避光保存。
f.洗涤I：加入适量预热的Washing Buffer I，24-65ºC摇床洗涤3次，每次5-20分钟。
注：洗涤时间与探针长度成正比，例如较短探针(20nt左右)洗涤5分钟；较长探针(约500nt)时，建议适当延长洗涤时间。
g.洗涤II：加入适量预热的Washing Buffer II，24-65ºC摇床5-20分钟，1次。
h.洗涤III：加入适量预热的Washing Buffer III，24-65ºC摇床5-20分钟，1次。
i.洗涤IV：加入适量预热的Washing Buffer Ⅳ，24-65ºC摇床5-20分钟，1次。
5.荧光染色
a.1X Streptavidin Buffer配制：用超纯水(DNase/RNase free)将Streptavidin Buffer (5X)稀释至1X，混匀备用。
b.洗涤：用1X Streptavidin Buffer摇床洗涤2次，每次5-10分钟。
c.封闭：加入适量含2% BSA (IgG-Free, Protease-Free)的1X Streptavidin Buffer，室温摇晃封闭30分钟。
d.孵育：按照适当比例使用含2% BSA (Fatty Acid & IgG Free, BioPremium) (ST025)的1X Streptavidin Buffer稀释的Streptavidin-488。弃封闭液，立即加入稀释好的Streptavidin-488，室温避光摇床上缓慢摇动孵育1-2小时。如果室温孵育1-2小时效果不佳，可以4ºC缓慢摇动孵育过夜。
注：Streptavidin-488推荐稀释范围为1:100-500，可根据实际情况进行适当优化。
e.回收：将Streptavidin-488回收至洁净离心管中，短时间内可以添加叠氮钠等防腐剂4ºC避光保存，或者-20ºC避光长时间保存。
6.细胞核染色：
a.清洗：用PBS避光摇床洗涤3次，每次5分钟。
b.细胞核染色：使用适量0.5-10μg/ml DAPI染色液浸没细胞，避光染色3-5分钟。
注：样本较大或较厚时建议适当延长染色时间；也可使用Hoechst 33342染色液(C1025/C1026)、Hoechst 33258染色液(C1017/C1018)、Propidium Iodide (ST511/ST512)等细胞核染料染色。
c.洗涤：用PBS避光摇床洗涤2次，每次5分钟。
7.拍照与保存：此时可以直接在荧光显微镜下拍照，也可以去除PBS，滴加抗荧光淬灭封片液(P0126)浸没细胞，盖上盖玻片，荧光显微镜下拍照。拍照后样品可放置4ºC避光保存。
常见问题：
1．为什么细胞或切片会脱落?
a.固定不充分。建议适当延长固定时间。
b.蛋白酶消化过度。适当降低蛋白酶浓度或缩短消化时间，消化后再次使用4%多聚甲醛固定液固定10分钟, 固定时间可酌情适当调整。
c.组织或细胞粘附性差。尝试不同的细胞外基质包被载玻片或盖玻片，例如多聚赖氨酸(C0312/C0313/ST508/ST509)或胶原蛋白，促进细胞和组织切片的粘附。
d.洗涤过于剧烈。建议缓慢加入或吸去试剂，避免溶液直冲细胞；同时可以考虑尽量减慢摇床速度，甚至不进行摇动。但不进行摇动时，一定要注意适当延长作用时间。
2．为什么细胞外会出现非特异性荧光信号？
a.探针与包被材料非特异结合。建议通过探针杂交有或无包被材料的载玻片或盖玻片来验证包被材料。
b.清洗不充分，样品上有杂质粘附。较多细胞碎片等杂质未洗净，建议所有洗涤步骤的洗涤时间增加5分钟。
c.样品晾干。在实验过程中，确保加入足够的溶液一直覆盖整个样品，更换溶液时需要逐个样品进行操作，吸净溶液后，需要立即加入后续的溶液，避免样品干燥。
d.试剂中存在杂质。如PBS等试剂未过滤去除杂质或沉淀物，建议相关溶液过滤后使用。
3．为什么细胞内部出现较高荧光背景？
a.探针非特异性。通常可以通过不加探针、使用阴性样品或使用sense probe杂交作为阴性对照，来判断是否为非特异性染色。如果阴性对照结果正常，antisense probe杂交有明显的非特异性染色现象，可适当降低探针浓度，并在探针杂交后适当延长洗涤时间。如果sense probe杂交也出现信号，说明探针具有非特异性，建议更换特异性探针。
b.样品自发荧光。一些细胞或组织样品可能会表现出较高的自发荧光。建议在实验前确定样品是否存在与探针荧光波长相近的自发荧光，如果有这样的情况，建议更换样品或更换不同波长的荧光染料偶联的Streptavidin。
c.洗涤不充分。在样品固定后及杂交后，所有洗涤步骤增加洗涤液的量或适当延长洗涤时间。
d.样品晾干。在实验过程中，确保加入足够的溶液一直覆盖整个样品，更换溶液时需要逐个样品进行操作，吸净溶液后，需要立即加入后续的溶液，避免样品干燥。
4．为什么样品整体出现较高且均匀的背景？
a.荧光显微镜设置不正确。检查荧光显微镜设置和成像系统，并进行正确设置。
b.使用的封片液的成分存在自发荧光。显微镜下，检查载玻片上的封片液是否具有自发荧光特性。如有，需要更换使用没有自发荧光的封片液。
5．为什么会出现荧光信号很弱或无荧光信号？
a.蛋白酶K消化不充分。建议调整蛋白酶K浓度或延长消化时间。
b.固定不充分。建议适当延长固定时间。
c.杂交温度偏高。建议尝试较低的杂交温度，此时相对比较容易检测到荧光信号，但也有可能会导致荧光背景的升高。
d.目标基因在被检测的细胞中没有表达或表达很低。使用阳性探针检测验证，例如18S rRNA生物素探针。
e.Streptavidin-488荧光淬灭。Streptavidin-488在使用和保存期间，须注意避光。荧光显微镜下观察时，需要尽量减少被激发光照射的时间。对于荧光已淬灭的情况，通常建议在低倍镜下先进行初步的观察，然后快速切换到20倍或40倍物镜下进行拍照，拍照完成后，关闭激发光或切换到低倍物镜下寻找下一个合适的视野。
f.试剂未作用于细胞样品。特别是细胞爬片，应确保含有细胞的面朝上，并用免疫组化笔做好标记。
g.荧光显微镜设置或操作不当。确保显微镜和拍照系统处于良好的工作状态。
h.RNA发生降解。需要确保所使用的溶液、器具都是DNase/RNase free的。
6．核定位的 RNA，为什么核内没有信号？
a.通透不充分。建议进行步骤2a时，在Proteinase K消化结束后，尝试增加用含0.5% Triton X-100的PBS室温摇床洗涤细胞5分钟。
b.样品晾干。在实验过程中，确保加入足够的溶液一直覆盖整个样品；更换溶液时，须避免样品干燥。
c.洗涤不充分。适当延长洗涤时间。注意使用指定的Washing Buffer，不可替换为其它溶液，且使用前需预热。
d.RNA发生降解。需要确保所使用的溶液、器具都是DNase/RNase free的。
7．为什么样品信号分布不均匀。
a.样品晾干。在实验过程中，确保加入足够的溶液一直覆盖整个样品，更换溶液时，须避免样品干燥。
b.杂交液使用不当。杂交液使用前应预热以充分溶解沉淀物并混匀。
参考文献：
1.Sriram K, Wiley SZ, Moyung K, Gorr MW, Salmerón C, et al. ACS omega. 2019. 4(16):17048-17059.
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