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核酸相关> RNA相关> 切割、合成、连接和修饰
RNase HII
产品编号: R7089S
产品包装:250U
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
R7089S RNase HII 250U 298.00元
R7089M RNase HII 1KU 958.00元
R7089L RNase HII 5KU 3826.00元

碧云天生产的RNase HII,即Ribonuclease HII,中文名为核糖核酸酶HII,也称核糖核酸酶H2 (RNase H2),是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种基因为大肠杆菌来源的重组核糖核酸内切酶。RNase HII能够催化双链DNA分子内部嵌入的单个核糖核苷酸或核糖核苷酸链的5′端磷酸二酯键的断裂,并产生一个5′端磷酸基团和一个3′端羟基。同时,RNase HII对单链RNA以及单链RNA和单链DNA杂合双链中的RNA的切割活性极低,对dsDNA、ssDNA无切割活性[1];此外,RNase HII还可沿着冈崎片段的RNA部分在多个位点进行缺刻(Nick)切割。

与RNase HI相比,RNase HII可识别双链DNA分子中的单个核糖核苷酸并进行切割,而RNase HI不能识别双链DNA中的单个核糖核苷酸;同时,RNase HII可降解冈崎片段,而RNase HI无此活性[2]。

图1. 碧云天生产的RNase HII工作原理图。

碧云天生产的RNase HII对嵌入单个核糖核苷酸的dsDNA的切割效果请参考图2。

图2. 碧云天生产的RNase HII (R7089)对嵌入单个核糖核苷酸的dsDNA的切割效果图。使用本产品或N公司(Competitor)的RNase HII,在25µl反应体系(20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 10mM KCl, 2mM MgSO4, 0.1%Triton X-100, pH8.8 @25ºC)中,加入50pmol的嵌入单个核糖核苷酸的双链DNA,以及图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的RNase HII,37ºC孵育30分钟进行反应,反应完毕后立即冰浴3-5分钟,并取出5μl反应产物,加入1μl DNA上样缓冲液(6X) (D0071),然后进行15%变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(180V电泳45分钟),随后用NA-Red (EB升级换代产品,2000X) (D0128/D0130)室温染色7分钟,在紫外灯下观察实验结果。如图所示,本产品与N公司的产品相比,对嵌入单个核糖核苷酸的dsDNA具有基本一致的催化切割效果。dsDNA with a ribonucleotide (也称嵌入单个核糖核苷酸的双链DNA)是使用Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) (D0251),并按照该产品说明书推荐的反应程序体系,把5'-CTCTTCAGCTCTATAGAAACCCACGCAAAGCCCTCAGCATTGG-3'和5'-GGGCTTTGCGTG(ribo)GGTTTCTATAG-3'这两条寡核苷酸链进行退火反应得到的产物,并以此退火产物为底物,进行嵌入单个核糖核苷酸的双链DNA分子的切割。不同的实验条件下获得的实际检测效果可能会略有不同,图中效果仅供参考。

用途:对掺有核糖核苷酸的聚合酶产物进行缺刻(Nick)切割;与T7核酸内切酶I一同使用,可在掺入核糖核苷酸的位点处切割产生双链断裂;降解冈崎片段或其它RNA-DNA嵌合链与DNA形成的双链中的RNA部分;区分异种同源基因;SNP检测和稀有等位基因检测;除去杂交到poly(dT)上的mRNA poly(A);在cDNA第二链合成时去除mRNA。

来源:纯化自携带编码大肠杆菌RNase HII核糖核酸内切酶基因的E.coli重组菌株。

分子量:约为20kDa (单体)。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme required to yield a fluorescence signal consistent with the nicking of 100 picomol of synthetic double-stranded DNA substrate containing a single ribonucleotide near the quencher of a fluorophore/quencher pair in 30 minutes at 37ºC in 1X Buffer.

纯度:不含除RNase HII之外其它种类的核糖核酸内切酶,不含外切酶。

酶储存溶液:20mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 1mM DTT, 1mM EDTA, 50% (v/v) glycerol, pH8.8 @25ºC。

10X Reaction Buffer: 200mM Tris-HCl, 100mM (NH4)2SO4, 100mM KCl, 20mM MgSO4, 1%Triton X-100, pH8.8 @25ºC。

失活:不能进行热失活;与0.1% SDS一起孵育可使RNase HII充分失活。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R7089S-1 RNase HII (5U/μl) 50μl
R7089S-2 10X Reaction Buffer 300μl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7089M-1 RNase HII (5U/μl) 200μl
R7089M-2 10X Reaction Buffer 1.2ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7089L-1 RNase HII (5U/μl) 1ml
R7089L-2 10X Reaction Buffer 6ml
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,两年有效。4ºC或室温保存,至少一周有效。

注意事项:

与RNase H相比,RNase HII对RNA/DNA杂交链中RNA的酶切活性较低。

RNase HII处理冈崎片段时,优先在RNA/DNA序列交界处的核糖核苷酸处产生5′缺刻。

相比与RNA/DNA杂交链或冈崎片段,RNase HII更倾向于切割含有单个核糖核苷酸的双链DNA分子。

用于依赖于RNase HII的PCR时(rhPCR),需要使用3′端带封闭基团的DNA引物。

RNase HII在50-75ºC之间均有活性,其用量可根据不同的应用进行适当调节。

RNase HII与绝大多数的PCR,LAMP等缓冲体系兼容。

RNase HII在Mg2+浓度为1-6mM之间的缓冲体系中均可发挥活性。

RNase HII极其耐热,95ºC 15分钟活性无明显降低,不能进行热失活;反应结束后加入0.1% SDS或DNA Loading Buffer (D0071)可使其充分失活。

使用说明:
1. 双链DNA中单个核糖核苷酸的缺刻切割或冈崎片段中与DNA相邻的核糖核苷酸5′端的切割。
a. 参考下表在冰上配制如下反应体系(50μl体系)。
Reagent Volume Final Concentration
dsDNA with a ribonucleotide xμl (100pmol) 2pmol/µl
10X Reaction Buffer 5μl 1X
RNase HII (5U/µl) 1μl 0.1U/µl
Nuclease-Free Water (ST876) (44-x)μl -
Total Volume 50μl -
注:为获得最好的底物切割效果,建议尝试多种RNase HII的加入量,摸索最优酶切反应体系。
b. 按照上表设置好反应体系后,适当轻轻混匀反应体系,随后低速离心以使粘附在管壁上的液体聚集于管底。
c. 反应条件:37ºC孵育30分钟。
注:反应时间可以根据实际情况适当调节和优化,以确保获得更好的酶切效果。
d. 终止反应:反应完成后,向反应体系中加入终浓度为0.1% SDS可使其充分失活。
e. 8M尿素变性PAGE电泳检测含单个核苷酸的双链DNA切割效果,或进行后续实验。
2. RNase HII与T7 Endonuclease I (D7080)同时使用,在双链DNA核糖核苷酸位点处切割产生双链断裂。
a. 参考下表在冰上配制如下反应体系(50μl体系)。
Reagent Volume Final Concentration
dsDNA with a ribonucleotide xμl (100pmol) 2pmol/µl
10X Reaction Buffer 5μl 1X
RNase HII (5U/µl) 1μl 0.1U/µl
T7 Endonuclease I (10U/µl) 2μl 0.4U/µl
Nuclease-Free Water (ST876) (42-x)μl -
Total Volume 50μl -
b. 按照上表设置好反应体系后,适当轻轻混匀反应体系,随后低速离心以使粘附在管壁上的液体聚集于管底。
c. 反应条件:37°C孵育15-30分钟。
注:反应时间可根据实际情况适当调节和优化,以确保获得更好的酶切效果。
d. 终止反应:反应完成后,向反应体系中加入终浓度为0.1% SDS可使其充分失活。
e. 8M尿素变性PAGE电泳检测双链DNA切割效果,或进行后续实验。
3. RNase HII-dependent PCR (rhPCR),即核糖核酸酶HII依赖性PCR:
rhPCR是一种依赖于RNase HII,基于其对含有单个核糖核苷酸的双链DNA分子的识别与切割而设计的PCR扩增反应,常被应用于基因表达分析,选择性剪接,SNP基因分型等方面。在rhPCR中,引物的3'端附近被设计含有单个核糖核苷酸,且3'端带有阻断分子,阻止了产物的延伸和扩增。带阻断引物的扩增依赖于引物与互补靶序列杂交期间RNase HII对其的切割活性。rhPCR处于变性程序时,反应体系中的引物和模板以游离形式存在,此时引物不会被RNase HII酶切割;反应进入退火程序后,引物会与特定模板互补配对结合形成含有单个核糖核苷酸的双链DNA,且由于引物3'端带有阻断分子,阻止了反应的延伸与扩增;同时,反应体系中存在的RNase HII会对引物的单个核糖核苷酸的5'端进行切割,移除阻断分子,释放引物3'-OH,使得DNA聚合酶从引物中延伸出来进行PCR的扩增(图3) [3]。PCR反应的循环继续这个过程。

图3. rhPCR (RNase HII-dependent PCR)工作原理示意图。

a. 引物设计。rhPCR的引物需设计成不能被DNA聚合酶进行延伸,且在3′末端附近含有单个核糖核苷酸。因此rhPCR的引物在设计时须符合以下三个要求:
a) 5′端长度,GC含量和Tm与常规PCR一致,以保证后续在被RNase HII切割后延伸的正常进行。
b) 单个核糖核苷酸,为RNase HII提供切割位点。
c) 3′端单个核糖核苷酸后为4个或5个核苷酸长度的延伸,再加上一个不可延伸的阻断分子,如双脱氧核糖核酸、丙二醇或其它封闭基团,以阻止DNA聚合酶的延伸,除非阻断分子被RNase HII酶切后移除。
b. 参考下表在冰上配制如下反应体系(50μl体系)。
Reagent Volume Final Concentration
10X BeyoTaq Buffer (with Mg2+) 5μl 1X
dNTP (2.5mM each) (D7371) 4μl 0.2mM each
Template DNA xμl 10pg-1μg*/50µl
Primer Mixture (10mΜ each) 4μl 0.8μM
RNase HII (5U/µl) 1μl 0.1U/µl
BeyoTaq DNA Polymerase (5U/µl) (D7218/D7219) 0.25μl 0.025U/µl
Nuclease-Free Water (ST876) (35.75-x)μl -
Total Volume 50μl -
*对于不同类型的模板在50μl反应体积中推荐用量如下:哺乳动物基因组DNA:0.1-1μg;大肠杆菌基因组DNA:10-100ng;质粒DNA:0.1-10ng。过多的模板DNA容易导致非特异性的PCR产物。
c. 使用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀,室温离心数秒,使液体积聚于管底。
d. 如果所使用的PCR仪有热盖则省略本步骤。如果PCR仪没有热盖,则在管内滴入一滴矿物油(ST275)。
e. 各设置好的PCR反应管置于PCR仪上,准备进行PCR反应。
f. rhPCR反应参数的设置可以参考如下示例:
STEP1(起始变性): 94ºC 3min
STEP2(变性): 94ºC 30sec
STEP3(退火): 55-60ºC 30sec
STEP4(延伸): 72ºC 2min
STEP5(循环): Go To STEP2 for 30 cycles
STEP6(最终延伸): 72ºC 10min
STEP7(临时保存): 4ºC forever
注1:PCR反应的设置需根据模板、引物、PCR产物的长度和GC含量等条件的不同设定不同的PCR反应条件包括温度、时间和循环数等。
注2:STEP4(延伸)的时间设置需根据PCR产物的长度进行设置,通常每kb产物的延伸时间为1.5分钟。例如PCR产物的长度为1kb,则延伸时间可以设置为1.5分钟,PCR产物的长度为2kb,则延伸时间可以设置为3分钟,以此类推。
注3:对于初次进行的PCR,为尽量确保可以扩增出预期的PCR产物,可以把循环数设置为35。对于需进行半定量或定量的PCR反应循环数一定要进行适当优化,使PCR反应没有达到平台期。
常见问题:
1. RNase HII不能进行热灭活。如何使RNase HII失活?
向反应体系中加入终浓度为0.1%的SDS,可使RNase HII充分失活。
2. RNase HII切割核糖核苷酸的哪一侧?
RNase HII在掺入到DNA双链中的单个核糖核苷酸的5′端进行切割,生成3'羟基端和5'磷酸端产物。
参考文献:
1. Itaya M. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990. 87(21):8587-91.
2. Rydberg B, Game J. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002. 99(26):16654-9.
3. Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR. BMC Biotechnol. 2011. 11:80.
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产品编号 产品名称 包装
ST576 RNase A (10mg/ml, DNase free) 1ml
ST577 RNase A (100mg/ml, DNase free) 0.5ml
ST578 RNase A (10mg/ml) 1ml
ST579 RNase A (100mg/ml) 0.5ml
D7089 RNase H 100U
R7088S RNase H 250U
R7088M RNase H 1000U
R7088L RNase H 5000U
R7089S RNase HII 250U
R7089M RNase HII 1KU
R7089L RNase HII 5KU
R7090S Thermostable RNase H 250U
R7090M Thermostable RNase H 1000U
R7090L Thermostable RNase H 5000U
R7090FT Thermostable RNase H 50U
R7092S RNase R 500U
R7092M RNase R 2KU
R7092L RNase R 10KU
R7096S RNase T1 100000U
R7096M RNase T1 500000U
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