使用说明：
1.样品的准备。
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟-2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay的比例加入裂解液，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。对于贴壁细胞，使用细胞刮或细胞铲，刮铲下细胞后再进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细菌样品的准备：取1ml OD600为0.5-2.0的菌液，5000×g 4ºC离心10分钟，弃上清。用100-200μl BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay重悬细胞，可短暂涡旋混合以充分重悬。使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。12,000-16,000×g (16,000×g更佳) 4ºC离心5分钟。小心吸取上清用于后继检测。制备好的细菌样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
d.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
注：对于细胞、组织、细菌等需要裂解的样品的准备，也可以用其它合适的裂解液进行裂解，但不同裂解液制备的样品的测定效果可能存在一定的差异，甚至有些裂解液可能会抑制酶活性。
2.试剂盒的准备。
a.融解ALDH Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.20mM NADH标准溶液的配制：在本试剂盒提供的5mg NADH中加入352.4μl ALDH Assay Buffer，充分溶解并混匀，即为20mM的NADH标准溶液。除待用部分外，其余NADH标准溶液适当分装后-80ºC避光保存。
c.ALDH反应工作液(Working Solution)的配制：按照每个反应80µl的体积配制适量的ALDH反应工作液。均匀混合71µl ALDH Assay Buffer、5µl Substrate A、2µl WST-8、2µl Substrate B，即可配制成80µl ALDH反应工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的ALDH反应工作液。具体配制方法参考下表。ALDH反应工作液须现配现用。

Samples	1	10	20	50
ALDH Assay Buffer (µl)	71	710	1420	3550
Substrate A (µl)	5	50	100	250
WST-8 (µl)	2	20	40	100
Substrate B (µl)	2	20	40	100
Working Solution (µl)	80	800	1600	4000

注1：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
注2：NADH的存在会对乙醛脱氢酶的检测产生干扰。如果样品含有NADH，需同时设置样品背景对照孔，加入不含Substrate B的ALDH Working Solution，即配制ALDH Working Solution时2µl Substrate B用ALDH Assay Buffer替代。计算时样品孔的读数值需要减去样品背景对照孔的读数。
3.样品测定。
a.NADH标准曲线设置。
取10μl NADH Standard (20mM)，加入90μl ALDH Assay Buffer，混匀，配制成浓度为2mM的NADH标准品。分别取2mM的NADH标准品0、0.2、0.5、1、2、5、10、20μl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用ALDH Assay Buffer补足至20μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、20、50、100、200、500、1000、2000µM。
b.阳性对照的设置：取适量体积的ALDH Positive Control (20X)，按照1:19的比例加入ALDH Assay Buffer将其稀释20倍，然后取20μl加入96孔板作为阳性样品。例如取阳性对照2μl，加入ALDH Assay Buffer 38μl，混匀后取20μl加入96孔板作为阳性样品。
c.取1-20μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入ALDH Assay Buffer至样品孔中，补足至20µl。同时设置仅含ALDH Assay Buffer的孔为空白对照。
注1：为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中乙醛脱氢酶的大致活性，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了5倍稀释，加入的“稀释后的样品”为10µl，则n=5×20/10=10)。
注2：对于血清、组织裂解液上清等复杂样品，建议将适当样品设置多个稀释倍数进行预实验，在适当的稀释倍数时，样品的信号值和样品中的蛋白量通常会呈现出良好的线性关系。再根据预实验的结果，选取适宜的稀释倍数用于后续的测定，否则即使信号值在标准曲线的线性范围内，也可能无法得到理想的检测结果。
d.各孔加入ALDH反应工作液80µl，混匀。
e.立即使用适当的酶标仪或微量紫外分光光度计测定A450，此时记录为0分钟读值A1。
f.25ºC反应10-30分钟，反应时间记为T，测定A450，记为A2。信号的增强取决于ALDH催化产生的NADH量，ΔA=A2–A1。
注：为取得最佳的检测效果，反应时间可以根据待测样品中的ALDH活性进行调整，但是必须确保读数在标准曲线范围内。对于ALDH活性较高的样品，建议测定总时间为20分钟或30分钟，对应的测定间隔时间设为2分钟或5分钟；对于ALDH活性较低的样品，可以延长测定总时间为1至2小时，对应的测定间隔时间设为10或20分钟。也可以连续测定30分钟，每隔1或2分钟测定1次，最后取呈线性的时间点前的数据用于分析和计算。
g.建立标准曲线，并计算样品中乙醛脱氢酶的活性(A)，如果样品的背景对照信号比较高，样品的信号值应减去样品背景对照的信号值。NADH标准曲线可以参考图2，在10-2000μM浓度范围内有良好的线性关系。乙醛脱氢酶活性的计算公式如下：
C (U/L)=A×n/T
注：A为步骤3g根据标准曲线确定的NADH浓度(µM)；
n为步骤3c样品总稀释倍数；
T为步骤3f的反应时间(min)。
乙醛脱氢酶酶活性单位的定义：在pH8.0、25ºC条件下，一个单位每分钟可以催化生成1.0μmole NADH。
参考文献：
1.Jackson B, Brocker C, Thompson DC, Black W, Vasiliou K, et al. Hum Genomics. 2011. 5(4):283-303.
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