使用说明：
1. 细胞或组织培养：
    把待检测的细胞或组织培养到96孔板内，通常以培养16-24小时后细胞为80-90%满为宜。可以留至
    少一个孔作为没有细胞的空白对照。
2. 试剂的准备：
    NADPH溶液的配制：加入1ml MilliQ级纯水，充分溶解并混匀，配制成2.5mM的NADPH溶液。分装
    成小管，当日不使用的立即-70℃冻存。取适量2.5mM NADPH，用NOS检测缓冲液稀释成0.1mM
    NADPH。
    NOS检测缓冲液的配制：取适量NOS检测缓冲液(2X)，加入等量MilliQ级纯水，混匀即成NOS检测缓
    冲液。
    检测反应液的配制：检测反应液参考下表配制，即1个反应就配制100微升，10个反应就配制1毫
    升。

    参考上表依次加入各种试剂，混匀后即为检测反应液。注意：DAF-FM DA较易下沉，配制时一定要注
    意把DAF-FM DA混匀。
3. 样品的检测：
    细胞或组织内一氧化氮合成酶的活性检测有如下两种方法：
    a. 边刺激边测定。对于短时间药物等刺激(通常2小时以内)可以显著提高一氧化氮合成酶活性的情
       况可以使用本方法。
       吸尽培养液，加入100微升NOS检测缓冲液。如果是悬浮细胞，可以将96孔板离心后吸去上清，或
       将生长良好的细胞直接从培养的器皿中离心收集后按照适当密度用NOS检测缓冲液重悬后，按照
       每孔100微升均匀加入到96孔板中。
       再加入100微升检测反应液，轻轻混匀。
       37℃细胞培养箱内孵育20-120分钟。具体孵育时间因不同的刺激和不同的细胞而不同，需自行摸
       索。对于经典的LPS和γ-IFN共同刺激RAW 264.7细胞，诱导一氧化氮合成酶活力的提高，孵育
       120分钟后检测，可以观察到刺激前后总的一氧化氮合成酶活力提高6-10倍。
       直接取该96孔板用荧光酶标仪检测。以没有细胞的孔为空白对照，激发波长为495nm，发射波长
       为515nm。用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪也可以进行检测。
    b. 先刺激后测定。对于需长时间刺激(通常6小时以上)才可以显著提高一氧化氮合成酶活性的情况
       可以使用本方法。
       细胞或组织刺激后，吸尽培养液，加入100微升NOS检测缓冲液。如果是悬浮细胞，可以将96孔板
       离心后吸去上清，再加入100微升NOS检测缓冲液。
       再加入100微升检测反应液，轻轻混匀。
       37℃细胞培养箱内孵育20-60分钟。具体孵育时间因不同的刺激和不同的细胞而不同，需自行摸
       索。
       直接取该96孔板用荧光酶标仪检测。以没有细胞的孔为空白对照，激发波长为495nm，发射波长
       为515nm。由于波长的设置和FITC检测时的波长设置非常接近，可以直接使用FITC的设置。用激
       光共聚焦显微镜或流式细胞仪也可以进行检测。
4. 样品中特定的一氧化氮合成酶的检测(本步骤可以和上述步骤3同时进行)：
    无论是边刺激边测定还是先刺激后测定，吸尽培养液后加入100微升含有适当浓度的特定一氧化氮合
    成酶抑制剂的NOS检测缓冲液。
    再加入100微升检测反应液，轻轻混匀。
    37℃细胞培养箱内孵育20-60分钟或20-120分钟。具体孵育时间因不同的刺激和不同的细胞而不同，
    需自行摸索。
    直接取该96孔板用荧光酶标仪检测。以没有细胞的孔为空白对照，激发波长为495nm，发射波长为
    515nm。由于波长的设置和FITC检测时的波长设置非常接近，可以直接使用FITC的设置。用激光共聚
    焦显微镜或流式细胞仪也可以进行检测。
5. 一氧化氮合成酶相对活力的计算：如果以没有刺激前样品中一氧化氮合成酶的活力为1，那么刺激
    后：
    样品中一氧化氮合成酶相对活力＝(RFU_已刺激－RFU_空白)/(RFU_未刺激－RFU_空白)
    RFU, relative fluorescence unit, 即为实际测定得到的相对荧光强度。
6. 特定一氧化氮合成酶相对活力的计算：例如检测时加了iNOS的抑制剂，如果以没有刺激前样品中
    一氧化氮合成酶的活力为1，那么刺激后：
   样品中iNOS酶相对活力＝(RFU_已刺激－RFU_{(抑制剂+已刺激)})/(RFU_未刺激－RFU_{(抑制剂+未刺激)})
7. 如果使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪进行检测，可以参考上述方法进行。

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