(2) 按照上述顺序依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温
(20-25℃)放置10分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,或者让
冷探针优先反应。然后加入标记好的探针,混匀,室温(20-25℃)放置20分钟。
(3) 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样。
注意:有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合,建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift
上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色
上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液,至能观察到蓝颜色即可。
2. 电泳分析:EMSA的典型分析结果可以参见下面的图1。
图1.一个典型的EMSA/Gel-Shift分析图
1,阴性对照反应(标记探针);
2,常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针);
3,探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的
未标记探针);
4,突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100
倍量的未标记突变探针);
5,Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+目的转录因子的特
异抗体)。
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