按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4

　　Polynucleotide　Kinase，混匀。
   (2)使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。
   (3)加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
   (4)再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率

　　　在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探

　　　针的标记效率。
   (5)标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存

　　　在-20℃。
2. 探针的纯化：
   通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善

　　EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：
   (1)对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加入2体积即200微

　　　升的无水乙醇，混匀。
   (2)在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。
   (3)在4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。
   (4)在4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干

　　　燥。
   (5)加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜

　　　超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
3. EMSA胶的配制：
   (1)准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好

　　　选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可

　　　灌制较大EMSA胶的模具。
   (2)按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis

　　　对结果影响不大)。

(3)按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入

　　到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一

　　块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
4. EMSA结合反应：
   (1)如下设置EMSA结合反应(预期的结果参见图1)：

　　(2)按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温

　　　（20-25℃）放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让

　　　冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。
    (3)加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。

　　　注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift

　　　上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样

　　　缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。
5. 电泳分析：
   (1)用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空

　　　余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否

　　　正常进行。
   (2)把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀

　　　释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
   (3)按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降

　　　低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，

　　　停止电泳。
   (4)剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，

　　　用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块

　　　(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个

　　　EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤

　　　纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一

　　　层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
   (5)在干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。EMSA

　　　的典型分析结果可以参见下面的图1。
                  
                   图1.一个典型的EMSA/Gel-Shift分析图
   1,阴性对照反应(标记探针)；

　 2，常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；

　 3,探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100倍量的

　　　未标记探针)；

　 4,突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100倍

　　　量的未标记突变探针)；

　 5,Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+目的转录因子的特异

　　　抗体)。