Western Blot全面解决方案第三讲——转膜
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转膜，顾名思义，是将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体上，同时维持其相对位置和分辨率的过程。
转膜方式主要有两种：湿转和半干转。两者原理相同，只是用于固定胶/膜叠层及施加电场的仪器有不同。半干转耗时短，但是更适合小分子蛋白的转印，而湿转蛋白分子量范围较宽，两者的比较见表1，在Western Blot实验中，常用的是湿转。
| 湿式转印系统 | 半干转印系统 |
| 小分子、大分子蛋白均可轻松转移 | 比较适合转移小分子蛋白（<120kD） |
| 转膜时间一般较长 | 转膜时间一般较短 |
表1.两种转膜方式的比较：
1转印膜的选择
杂交膜的选择也是Western Blot实验中一个重要的环节，需要根据杂交方案，被转移蛋白的特性及蛋白分子量大小等条件去选择合适材质、孔径和规则的杂交膜。Western Blot实验中最常用的转印膜有两种：PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）和NC膜（硝酸纤维素膜）。
NC膜对于分子量较小的蛋白质会在洗涤时丢失，且NC膜韧性较差，易损坏，操作室容易卷，对操作的技巧要求较高；而PVDF膜在机械强度和化学相容性上都具有更优越的性能，且灵敏度高、分辨率和蛋白亲和力较其他的膜要高，非常适合分子量较小的蛋白质检测，但是需要甲醇预先活化，成本较高。
对于两种膜的比较，详见表2。
| PVDF膜 | NC膜 |
| 机械强度高，质地柔韧，易于保存 | 脆而易碎 |
| 化学稳定性好，耐腐蚀，不易降解 | 溶剂不耐受 |
| 蛋白结合能力相对较高 | 蛋白结合能力相对较低 |
| 可用于多次剥离和杂交 | 不利于多次剥离和杂交 |
| 需要甲醇等溶液浸泡预湿活化 | 不需要预湿处理 |
| 价格较高 | 价格较低 |
表2.两种常用转印膜的比较
选到合适材质的膜之后，还需要根据需检测蛋白的大小，选择合适的膜孔径。Western Blot转印膜通常有两种孔径大小：0.2μm和0.45μm。
0.2μm ：特别适合小于20kD的蛋白；推荐用于低丰度蛋白检测。
0.45μm：更加常用，适合大于20kD的蛋白；比表面积较小，背景较低。
碧云天提供多种不同规格的膜产品，比较如下：
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 使用便捷性 | 推荐指数 | 主要描述和用途 |
| FFN02 | 硝酸纤维素膜(进口分装, 6.3×8.3cm, 0.45μm) | 20张/包装 | 很方便 | ++++ | 适用于western blot的转印，以及核酸检测的转印 |
| FFN03 | 硝酸纤维素膜(进口分装, 6.3×8.3cm, 0.45μm) | 100张/包装 | 很方便 | ++++ | 适用于western blot的转印，以及核酸检测的转印 |
| FFN05 | 硝酸纤维素膜(进口分装, 15.6×16.6cm, 0.45μm) | 5张/包装 | 较方便 | +++ | 适用于western blot的转印，以及核酸检测的转印 |
| FFN08 | 硝酸纤维素膜(进口原装, 33cm×3m/卷, 0.45μm) | 1卷/包装 | 一般 | ++ | 适用于western blot的转印，以及核酸检测的转印 |
| FFP24 | PVDF膜(进口分装, 6.6×8.5cm, 0.2μm) | 20张/包装 | 很方便 | ++++ | 适用于western blot时分子量小于20kDa蛋白质的转印 |
| FFP26 | PVDF膜(进口分装, 6.6×8.5cm, 0.2μm) | 100张/包装 | 很方便 | ++++ | 适用于western blot时分子量小于20kDa蛋白质的转印 |
| FFP28 | PVDF膜(进口原装, 26.5cm×3.75m/卷, 0.2μm) | 1卷/包装 | 一般 | ++ | 适用于western blot时分子量小于20kDa蛋白质的转印 |
| FFP32 | PVDF膜(进口分装, 6.6×8.5cm, 0.45μm) | 20张/包装 | 很方便 | +++++ | 适用于western blot时分子量大于20kDa蛋白质的转印 |
| FFP33 | PVDF膜(进口分装, 6.6×8.5cm, 0.45μm) | 100张/包装 | 很方便 | +++++ | 适用于western blot时分子量大于20kDa蛋白质的转印 |
| FFP36 | PVDF膜(进口分装, 8.5×13.2cm, 0.45μm) | 10张/包装 | 较方便 | ++++ | 适用于western blot时分子量大于20kDa蛋白质的转印 |
| FFP39 | PVDF膜(进口原装, 26.5cm×3.75m/卷, 0.45μm) | 1卷/包装 | 一般 | +++ | 适用于western blot时分子量大于20kDa蛋白质的转印 |
表3.碧云天转印膜比较：
1、对于用量较小的情况，优先推荐选择预裁切的20片/包装产品，使用比较便捷也可以避免浪费。对于用量较大的情况，推荐使用预裁切的100片/包装或整卷产品。预裁切产品无需再进行裁切，使用非常便捷；并且由于机械化裁切的效率很高，可以避免手工裁切导致的膜裁切时的浪费。
2、一般Western Blot推荐使用预裁切的孔径为0.45μm的PVDF膜（FFP32/FFP33），也可以使用硝酸纤维素膜（FFN02/FFN03）。但PVDF膜的蛋白吸收性能比硝酸纤维素膜更好一些，而且不易破裂或卷曲，缺点是需要用乙醇、甲醇或其它适当的溶液中浸泡活化后使用。
3、对于分子量小于20kDa蛋白的检测，可以选择孔径为0.2μm的PVDF膜（FFP24/FFP26）。但如果既要检测大分子量又要检测小分子量的蛋白，只要蛋白分子量不是特别小，如10-15kDa，可以使用孔径为0.45μm的PVDF膜（FFP32/FFP33），此时胶的浓度可以适当提高，例如10-15%左右，电泳的时间适当增加，以使目标蛋白适当分开但又不会跑出去。
2转膜操作
1.转膜液的配制
转膜之前先提前配好1x转膜液，也可以直接购买碧云天配制好的的Western转膜液(P0021A/P0021B)，提前放在4℃冰箱或冷库进行预冷处理。
2.PVDF膜活化
将膜产品浸润在甲醇或安全无毒的碧云天PVDF膜浸润活化液（P0021S）中活化，保证膜由不透明变成透明，然后小心将膜放入提前配好的转膜液中平衡。如果使用活化液，只需简单地用转膜液洗涤数秒，即可被快速平衡并用于后续的转膜等实验。
3.转膜装置的组装
在加有转膜液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子（E6065）、两块 转移衬垫（E6061）、滤纸（FFP51）和已经活化好的膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。然后依次放入转移衬垫（海绵垫）-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-转移衬垫（海绵垫），制成“三明治”结构。
整个操作在转膜液中进行，并使用专业赶气泡滚子（E6071）滚动赶走气泡，要保证夹子、海绵垫、滤纸、胶、膜之间没有气泡。将夹子夹好后放入转移槽中，要使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。
转膜夹子放入槽中后，加入足够的转膜液，盖上盖子，插好电源，准备转膜。
转膜时会有比较明显的产热现象，并导致转膜液的电阻变小，最终影响转膜效率、转膜液的缓冲能力、甚至过热导致凝胶熔化或黏附在膜上。因此建议转膜时，在转膜槽内用冰盒（E6069）降温，并将转膜槽置于冰浴中。
碧云天提供MiniBlot™蛋白转膜系统（E6050）、BeyoPower™系列电泳仪电源（E6085/E6080），以及相应的配件等
详情请点击链接：
https://www.beyotime.com/support/news-events20190228.htm。
碧云天提供转膜过程需要的多种产品，详情如下：
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| E6050 | MiniBlot™蛋白转膜系统 | 1套 |
| E6053 | MiniBlot™蛋白转膜转移芯 | 1套 |
| E6150 | MiniProGel™蛋白制胶、电泳与转膜系统(2胶/2膜) | 1套 |
| E6155 | MiniProGel™蛋白制胶、电泳与转膜系统(4胶/2膜) | 1套 |
| E6159 | MiniProGel™蛋白制胶、电泳与转膜系统(4胶/4膜) | 1套 |
| E6080 | BeyoPower™ 中电流电源(300V/600mA/100W) | 1套 |
| E6085 | BeyoPower™ 高电流电源(300V/2000mA/200W) | 1套 |
| E6061 | MiniBlot™小型转移衬垫 | 4片/包 |
| E6065 | MiniBlot™小型转移三明治夹 | 1个 |
| E6069 | MiniBlot™蓝冰冰盒 | 1个 |
| E6071 | MiniBlot™赶气泡滚子 | 1个 |
| P0021A | Western转膜液 | 1L |
| P0021B | Western转膜液 | 10×1L |
| P0021C | Western半干法转膜液 | 1L |
| P0021D | Western半干法转膜液 | 10×1L |
| P0021S | PVDF膜浸润活化液 | 250ml |
| FFP51 | 转印滤纸(7.5×10cm) | 100张/包装 |
| FS035 | WB专用镊子(12cm, 翘方头) | 1把 |
碧云天的转膜仪器和设备完全兼容伯乐（Bio-Rad）公司的电泳仪器和配件，可以根据实验室的需求选择合适的转膜设备或配件等。
在挑选电源时，BeyoPower™中电流电源的输出电流最高为600mA，能同时满足电泳和转膜的要求；BeyoPower™高电流电源的输出电流最高为2000mA，最大功率达到200W，除了能达到BeyoPower™中电流电源的性能外，还能能满足高电流电泳或者2-3个电泳槽同时转膜的需要。
4.转膜时间
对于湿转法：一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的>50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
3转膜效果鉴定
如果想看转移后的效果，可对凝胶进行染色，可以用碧云天丽春红染色液(P0022)，来观察实际的转膜效果。或者用碧云天BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液(P0017F)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
但其实有一个更简单快速的方法就是通过预染marker来判断。看凝胶上是否有marker残留以及转印膜上marker的清晰度。
相关产品信息：
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| P0022 | 丽春红染色液 | 120ml |
| P0017F | BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液 | 250ml |
| P0017 | 考马斯亮蓝快速染色液 | 250ml |
| P0017B | 考马斯亮蓝染色液(常规法) | 250ml |
| P0017C | 考马斯亮蓝染色脱色液(常规法) | 500ml |
| P0017A | 考马斯亮蓝染色试剂盒(常规法) | 1盒 |
4注意事项
1、注意一定要戴手套或镊子接触膜，推荐使用碧云天WB专用镊子（FS035），避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。
2、Western Blot中夹取PVDF膜最好使用平头镊子，并夹住膜左上角，可最大程度减小对膜上蛋白的损害。
3、湿转时，对胶、膜和滤纸的大小没有要求。半干转时，注意滤纸可以比胶或者膜稍小一些，否则上下层滤纸之间接触，易造成短路。
4、滤纸的主要作用是起支持作用，可根据自己的实验设备选择合适的滤纸数量。只要合上夹子时不会过紧或过松即可。
5、转膜时转膜液的温度、凝胶的参数(如数量、厚度、离子浓度、丙烯酰胺浓度等)、滤纸的厚度、同时使用的转膜槽数量、转膜液的离子浓度、转膜液的体积、转膜液使用的次数等都可能会影响电流和电压。电泳同时使用的转膜槽数量是最关键因素，如果是恒流，每增加一个转膜槽，每个槽的电流和电压都会相应减少一份。如果需要同时使用2个或以上的转膜槽，建议使用高电流的大功率电源，或者设定较低的电流或电压进行比较长时间的转膜。