碧云天的BeyoFast™ Probe One-Step qRT-PCR Kit (防污染型, 含示踪染料)，即BeyoFast™ Probe One-Step qRT-PCR Kit with UDG and Tracking Dyes，是一种基于TaqMan等探针的用于一步法反转录实时荧光定量PCR，即qRT-PCR (Quantitative Reverse Transcription PCR)或Real-time RT-PCR，含双染料示踪系统(with a dual-dye tracking system)的新型高品质防污染(Carryover prevention)试剂盒，主要用于RNA的特异性超高灵敏度定量检测。可利用两种示踪染料混合后产生的变色效应追踪移液过程，方便用户分辨空白孔和加入qPCR Mix的孔，并确认体积较少的RNA样品是否已经添加到qPCR Mix中，可快速便捷的用于RNA的特异性超高灵敏度定量检测。本产品含有优化比例的高品质UDG酶和dUTP，可有效消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题造成的假阳性或CT值偏低。

UDG (Uracil-DNA Glycosylase)，也称UNG (Uracil-N-glycosylase)，可催化含尿嘧啶的DNA链中的尿嘧啶(dU)碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键发生水解，从而释放游离尿嘧啶，主要应用于消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题。其防止污染的原理为：在PCR反应中加入适量的dUTP，以dUTP替代dTTP掺入DNA中，形成含dU碱基的PCR扩增产物；后续进行PCR反应时，使用UDG酶选择性切割可能被污染而带入的之前PCR扩增产生的含有dU的单链或双链DNA，从而避免之前的PCR扩增产物可能的污染对于本次PCR扩增带来的负面影响。

在进行qPCR反应体系的溶液配制时，由于RNA样品加入的体积通常只有1-2微升左右，很难通过肉眼分辨是否已经加入了样品。本产品中的BeyoFast™ Probe One-Step Reaction Buffer (2X, Blue)中添加有示踪作用的惰性蓝色染料，同时提供具有惰性黄色染料的模板稀释液Template Dilution Buffer (40X, Yellow)，在配制qPCR反应体系时，随着两个组分的混合，溶液颜色会产生显著变化，即当黄色溶液加入到蓝色溶液中后，变成绿色溶液，从而可以根据液体颜色准确判断是否已加入RNA模板和qPCR mix，这就在加样过程中起到示踪作用，提高qPCR体系设置的正确率，避免漏加或错加模板等[1]。

本产品以提取的RNA为模版，使用qPCR引物在同一反应管内连续进行反转录和荧光定量PCR，操作简单快速，最大限度地减少人为误差，有效降低污染风险，节约PCR实验的操作时间，检测通量大。

本产品整合了高效的BeyoRT™ M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor和优异的抗体结合型热启动BeyoFast™ Taq DNA Polymerase，并优化了缓冲体系，反转录性能优、检测灵敏度高、扩增特异性强、反应稳定性好，非常适合于内源低丰度RNA、外源病毒RNA等微量RNA的检测。

本产品的特异性好、灵敏度高。特异性并不仅仅依赖于PCR引物，还依赖于探针的特异性，探针和目标基因发生特异性的结合和降解，才能生成荧光信号，检测灵敏度和特异性通常要显著高于使用SYBR Green等荧光染料的方法。

本产品可用于多重检测。单个反应孔中，不同基因对应不同探针，不同探针对应不同荧光标记，即可进行多重荧光定量PCR检测。经测试，在适当优化引物和探针后，本产品可同时用于2-3个基因的检测。

本产品采用了荧光基团和淬灭基团(Quencher)标记的DNA探针靶向拟通过PCR检测的目标序列(设计的探针结合位点通常位于两条引物结合位点之间)的原理。正常情况下，探针上的淬灭基团由于空间上的荧光共振能力转移(FRET)而导致荧光基团淬灭。在PCR反应扩增目标序列时，引物和探针都会退火到目标基因上，随着引物的延伸，Taq酶的5'→3'外切酶活性会导致结合在目标序列上的探针从5'端开始逐渐被降解。探针的荧光基团和淬灭基团被Taq酶切开后，淬灭基团的作用消失，荧光基团就能正常地被激发光所激发而产生荧光了。

经反复验证，本产品中添加的蓝色和黄色两种惰性示踪染料的光谱与荧光基团和淬灭基团不重叠，不会影响荧光定量检测，也不影响扩增体系的酶活性(图1)。每经过一个PCR循环，就会有更多的荧光基团被释放，荧光强度与新合成的目标片段数量成正比，从而就可以实现定量检测了。探针通常是目标序列特异性的一段线性DNA，5'端标记FAM或HEX等荧光基团，3'端标记BHQ1、TAMRA或MGB等荧光淬灭基团。

本产品中使用的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase是一种与抗体结合的高品质热启动酶，能够实现便捷高效的热启动。BeyoFast™ Taq DNA Polymerase中的Taq酶与抗Taq酶的单克隆抗体相互结合，从而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，这样可以有效避免在低温条件下由引物和模板DNA非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。在PCR反应的预变性步骤中抗体会被加热失活，这样可以确保仅在预变性后才会把Taq酶的活性释放出来，预变性之前不会发生DNA聚合反应，从而大大提高了PCR反应的特异性、灵敏度和定量检测的准确性[2, 3]。

本产品中的BeyoFast™ Probe One-Step Reaction Buffer (2X, Blue)包含了蓝色示踪染料、PCR Buffer、dNTPs、稳定剂和镁离子等所有的通用组分，使操作更简单、使用更便捷。用户只需自备引物、样品RNA和去离子水即可。

图1. 碧云天BeyoFast™ Probe One-Step qRT-PCR Kit (含示踪染料)系列产品与BeyoFast™ Probe One-Step qRT-PCR Kit系列产品的扩增效果对比图。如图A-C所示，将RNA样品进行6个10倍梯度稀释，分别使用添加双重示踪染料的本产品(With tracking dyes)和未添加示踪染料的BeyoFast™ Probe One-Step qRT-PCR Kit (D7277) (Without tracking dyes)进行扩增检测。图A、图B分别为本产品和D7277的扩增曲线图；图C为根据图A和图B扩增曲线的CT值绘制的标准曲线，横坐标为稀释后的样品经计算后的拷贝数的对数(Log₁₀)，纵坐标为对应的CT值；图D为分别使用添加双染料示踪指示剂的本产品和D7277对30个基因进行扩增，横、纵坐标分别为D7277和本产品扩增不同基因的CT值，结果显示两个产品使用效果基本一致。本系列产品的效果图以BeyoFast™ Probe One-Step qRT-PCR Kit (含示踪染料) (D7629)为例，实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本产品提供了Low ROX和High ROX，广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动，从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起，如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。通常含高浓度ROX的BeyoFast™ Probe One-Step qRT-PCR Kit (防污染型, 含示踪染料)也可以用于不需要ROX或需要低浓度ROX的荧光定量PCR仪。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。

本系列产品稳定性好，在37ºC条件下保存3天不影响产品扩增效果(图2)。

图2. 碧云天BeyoFast™ Probe One-Step qRT-PCR Kit (含示踪染料)系列产品的稳定性检测效果图。将37ºC保存3天与-20ºC正常保存的本产品用于相同模板的扩增对比分析，结果显示以上两种储存条件下qPCR产物CT值基本无差异。本系列产品的效果图以BeyoFast™ Probe One-Step qRT-PCR Kit (含示踪染料) (D7629)为例，实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

相对于同类产品(Competitor)，本产品颜色差异更显著、扩增性能更灵敏(图3)。

图3. 碧云天BeyoFast™ Probe qPCR Mix (含示踪染料)系列产品与国内同类产品(Competitor)的颜色差异与检测效果对比图。图A为本产品与同类产品稀释至1X时的外观颜色对比分析，第一列与第四列的蓝色孔(1X Blue)为稀释至1X的含蓝色示踪染料的Probe qPCR Mix，第二列与第五列的黄色孔(1X Yellow)为稀释至1X的含黄色示踪染料的Template Dilution Buffer，第三列与第六列的绿色孔(Mixer)为稀释至1X的含蓝色示踪染料的Probe qPCR Mix与含黄色示踪染料的DNA模板的混合物。经对比，本产品的颜色差异更显著，示踪效果更明显。图B为本产品与同类产品对标准品质粒的qPCR检测扩增曲线对比分析，相对于同类产品，本产品扩增的CT值略低，检测效果略更灵敏。本系列产品的效果图以BeyoFast™ Probe qPCR Mix (含示踪染料) (D7616)为例，实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本产品如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20µl)，小包装可以进行100次检测，中包装可以进行500次检测；如果用于常规的384孔板qPCR检测(建议反应体系为10µl)，小包装可以进行200次检测，中包装可以进行1000次检测。

-20ºC避光保存，一年有效；4ºC避光保存，一个月内有效。尽量避免反复冻融。

探针的荧光标记须根据所使用的qPCR仪荧光兼容性来确定。对于需要ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪，避免使用ROX标记探针。

请注意避免RNase污染，使用RNase-free的枪头，离心管等。

用于多重检测时，需要适当优化引物和探针，并使用适当的不同荧光基团标记探针，确定效果后再进行多重检测，一般建议不超过三重检测。

Probe One-Step Enzyme Mix (20X, UDG)含有高浓度甘油，粘度高，使用前将短暂离心至管底，并用移液器轻轻混匀，混匀过程中尽量避免产生气泡，然后缓慢准确吸取。

使用前需确保本产品完全融化，上下颠倒轻轻混匀后使用。混匀过程中尽量避免产生气泡。

如果扩增片段较长或者RNA结构较为复杂，可将模板RNA在65ºC预处理5-10分钟，可提高反转录效率。

本反应使用qPCR的Reverse Primer作为反转录的基因特异性引物，不能使用Random Hexamer Primer或Oligo (dT) Primer等常用于cDNA第一链合成的引物。

注意引物退火温度，当退火温度<60ºC时，推荐使用三步法PCR扩增。

对于超过350bp或者高GC含量的扩增片段，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。

经测试，本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响。但仍需尽量避免反复冻融本产品，反复冻融可能使产品性能下降。

qPCR检测是超高灵敏度的检测，尽管本产品有很好的防污染效果，PCR反应设置区域还是需尽量避免各种可能的待扩增产物的污染。PCR产物宜密封后丢弃，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

超纯水推荐选购碧云天生产的BeyoPure™ Ultrapure Water (PCR级, Sterile) (ST873)。

qPCR的内参引物和目的基因引物推荐选购碧云天预先设计、经过qPCR验证、预混的引物对产品。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。