使用说明：
1.质粒的扩增和鉴定：
a.扩增：请先取少量本质粒转化DB3.1感受态细胞或其它适当的感受态细胞，Amp抗性，进行质粒的小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。DB3.1感受态细胞推荐使用碧云天的
DB3.1超级感受态细胞(D1025)。
b.鉴定：抽提获得的质粒可使用菌落PCR的方法进行鉴定，Forward primer为5′
TATACGATACAAGGCTGTTAGAGAG3′，Reverse primer为5′
ACTGTGGGCGATGTGCGCTCTG3′，PCR产物约为700bp。也可进一步测序鉴定，测序引物为hU6，Forward primer为5′
ATGGACTATCATATGCTTACCGTA3′。比对序列为：
ATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTG。其中N为sgRNA序列。注：本对照质粒中无sgRNA。
2.慢病毒包装与浓缩：
a.细胞的准备：复苏用于慢病毒包装的HEK293T细胞，24小时后1:3传至10cm培养皿，37℃、5% CO
2培养箱24小时。复苏后的细胞尽量能培养一周以上后再进行慢病毒的包装，效果更好。
b.慢病毒的包装：对于10cm培养皿，在500µl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM
® Medium中加入本sgRNA质粒、pMDLg、Rev、VSV-g分别为10µg、6.5µg、2.5µg、3.5µg，混匀后加入一定量转染试剂和培养液混合液，转染试剂推荐使用
Lipo293™转染试剂(C0521)、
Lipo6000™转染试剂(C0526)、
Lipo8000™转染试剂(C0533)或其它合适的转染试剂，具体转染步骤参考特定转染试剂的产品说明书。转染后24小时和48小时可两次收集培养液上清，上清用0.45µm的针头滤器进行过滤，该上清含慢病毒，可直接使用。上清可分装后-80℃冻存。
c.慢病毒的浓缩：如果需要滴度更高的慢病毒，可以使用100kDa的超滤管进行超滤浓缩，如碧云天的
超滤管(15ml, 100kDa MWCO, PES, Sartorius分装) (FUF158)或Amicon
® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit (UFC9100)，4℃、按照推荐的最高转速离心30分钟左右，最终剩下约400µl的病毒浓缩液。病毒浓缩液可以分装后-80℃冻存。
3.慢病毒的感染：
a.确定puromycin的筛选浓度：待感染的细胞按一定密度铺在12孔或24孔中，按照0、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5µg/ml这样的浓度测试细胞对puromycin的敏感性，推荐使用碧云天的
Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) (ST551)。两天后细胞全部死亡的最低浓度即为该细胞的puromycin筛选浓度，具体步骤参考碧云天该产品的使用说明：
https://www.beyotime.com/product/ST551-10mg.htm。
b.慢病毒感染细胞：按实验需要将细胞铺板(如12孔板)，细胞数以第2天密度约50%为宜。设置非感染细胞组、对照组和基因敲除组。37℃培养过夜后，培养液中加入5~10μg/ml的
Polybrene(C0351/ST551)。病毒感染前，从-80℃冰箱取出病毒后冰浴融化，参考相关文献或者根据预实验得到的MOI值加入适量病毒，对于未浓缩的病毒，可以直接按0.5ml/孔加入细胞，对于浓缩或测定滴度的病毒，一般100µl/孔或107 TU已经足够，轻轻摇匀，37℃继续培养。两天后，吸除含病毒的培养液，换为新鲜的含一定浓度的puromycin的培养液进行筛选，一般筛选2天后，非感染细胞组细胞逐渐死去，加入病毒组存活率比较高，就可以收集部分细胞检测目的蛋白的表达或进行其它实验。培养过程中，可以将细胞转至6孔板或10cm培养皿进行扩大培养。一周之后，puromycin浓度可减半。如果有必要后续可以通过将细胞稀释至2.5个/ml，然后按照每孔200µl接种到96孔板中(每孔平均0.5个细胞)，筛选单克隆细胞株。病毒感染的方法可参考
Polybrene (C0351)的使用说明：
https://www.beyotime.com/product/C0351-1ml.htm。
4.直接转染细胞与稳定株的筛选
a.选择合适的拟敲除目的基因的细胞，使用
Lipo8000™转染试剂(C0533)、
Lipo6000™转染试剂(C0526)或其它合适的转染试剂，具体转染细胞的步骤参考特定转染试剂的产品说明。
b.确定puromycin的筛选浓度：细胞按一定密度铺在12孔或24孔中，按照0、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5µg/ml这样的浓度测试细胞对puromycin的敏感性，推荐使用碧云天的
Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) (ST551)。两天后细胞全部死亡的最低浓度即为该细胞的puromycin筛选浓度，具体步骤参考碧云天该产品的使用说明：
https://www.beyotime.com/product/ST551-10mg.htm。
c.转染后约48小时，按照上述检测获得的puromycin筛选浓度加入puromycin，筛选阳性细胞。一般筛选2天后，阴性细胞逐渐死去。培养过程中，可以将细胞转至6孔板或10cm培养皿进行扩大培养。一周之后，puromycin浓度可减半。如果有必要后续可以通过将细胞稀释至2.5个/ml，然后按照每孔200µl接种到96孔板中(每孔平均0.5个细胞)，筛选单克隆细胞株。
5.基因编辑的鉴定：
a.对于多克隆细胞，可以通过T7 Endonuclease I (T7EI)进行鉴定，即提取细胞的基因组DNA，在sgRNA序列两边设计引物进行PCR扩增，然后进行T7EI酶切，具体请参考碧云天的
T7 Endonuclease I (CRISPR等基因突变鉴定用) (D7080)或
基因组编辑突变检测试剂盒(D0508)；也可以通过相应的抗体进行检测。
b.对于单克隆细胞，可通过PCR扩增出sgRNA靶向的基因片段后进行常规测序的方式进行验证，同时也可以使用相应的抗体进行检测。
相关产品：
| 产品编号 |
产品名称 |
包装 |
| L00002-5µg |
CRISPR/Cas9 Packaging Vectors Set A |
5µg/each |
| L00002-100µg |
CRISPR/Cas9 Packaging Vectors Set A |
100µg/each |
| L00011-5µg |
pLenti-Control-sgRNA |
5µg |
| L00011-100µg |
pLenti-Control-sgRNA |
100µg |
| L00013-5µg |
pLenti-GFP-sgRNA |
5µg |
| L00013-100µg |
pLenti-GFP-sgRNA |
100µg |
| C0222 |
青霉素-链霉素溶液(100X) |
100ml |
| C0351-1ml |
Polybrene (Hexadimethrine Bromide) |
1ml |
| C0351-50mg |
Polybrene (Hexadimethrine Bromide) |
50mg |
| C0521 |
Lipo293™转染试剂 |
0.5/1.5/7.5ml |
| C0526 |
Lipo6000™转染试剂 |
0.5/1.5/7.5ml |
| C0533 |
Lipo8000™转染试剂 |
0.5/1.5/7.5ml |
| D0378 |
Stbl3甘油菌 |
200μl |
| ST551-10mg |
Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) |
10mg/ml×1ml |
| ST551-50mg |
Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) |
10mg/ml×5ml |
| ST551-250mg |
Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) |
250mg |
| ST1380-500mg |
Polybrene (≥94%, Reagent grade) |
500mg |
| ST1380-2g |
Polybrene (≥94%, Reagent grade) |
2g |
| ST1380-10g |
Polybrene (≥94%, Reagent grade) |
10g |
| FF345-10pcs |
针头滤器(0.45µm/28mm, PES, Sterile, Sartorius分装) |
10个/袋 |
| FF345T-10pcs |
针头滤器(0.45µm/28mm, PES, Sterile, 进口分装) |
10个/袋 |
| FF345-50pcs |
针头滤器(0.45µm/28mm, PES, Sterile, Sartorius原装) |
50个/盒 |
| FF365-10pcs |
BeyoGold™针头滤器(0.45µm/33mm, PES, Sterile) |
10个/袋 |
| FF365-100pcs |
BeyoGold™针头滤器(0.45µm/33mm, PES, Sterile) |
100个/盒 |
| FF375-10pcs |
BeyoGold™针头滤器(0.45µm/13mm, PES, Sterile) |
10个/袋 |
| FF375-100pcs |
BeyoGold™针头滤器(0.45µm/13mm, PES, Sterile) |
100个/盒 |
| FUF158-2pcs |
超滤管(15ml, 100kDa MWCO, PES, Sartorius分装) |
2个/袋 |
| FUF158-12pcs |
超滤管(15ml, 100kDa MWCO, PES, Sartorius分装) |
12个/袋 |
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