使用说明：
1.试剂盒的准备。
a.融解Glucose Uptake Assay Buffer、Glucose Uptake Lysis Buffer、KRPH Buffer、Stop Buffer、GR Buffer和2-DG (10mM)，平衡至室温后混匀备用。Reaction Mix、Recycling Mix、Enzyme Solution A、Enzyme Solution B、DTNB (5X)于融解后放置于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.Reaction Mix反应工作液(Reaction Mix Working Solution)的配制：按照每个反应20μl的体积配制适量的Reaction Mix反应工作液。均匀混合14μl Glucose Uptake Assay Buffer、4μl Enzyme Solution A和2μl Reaction Mix，即可配制成20μl Reaction Mix反应工作液。根据待检测样品和标准品的数量，配制适量的Reaction Mix反应工作液。具体配制方法参考下表。配制好的Reaction Mix反应工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天数小时内使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
Glucose Uptake Assay Buffer (µl)	14	140	280	700
Enzyme Solution A (µl)	4	40	80	200
Reaction Mix (µl)	2	20	40	100
Reaction Mix Working Solution (µl)	20	200	400	1000

注：由于Enzyme Solution A和Recation Mix的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
c.Recycling Mix反应工作液(Recycling Mix Working Solution)的配制：按照每个反应25µl的体积配制适量的Recycling Mix反应工作液。均匀混合20µl Glucose Uptake Assay Buffer、1μl Enzyme Solution A、2μl Recycling Mix和2μl Enzyme Solution B，即可配制成25μl Recycling Mix反应工作液。根据待检测样品和标准品的数量，配制适量的Recycling Mix反应工作液。具体配制方法参考下表。配制好的Recycling Mix反应工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天数小时内使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
Glucose Uptake Assay Buffer (µl)	20	200	400	1000
Enzyme Solution A (µl)	1	10	20	50
Recycling Mix (µl)	2	20	40	100
Enzyme Solution B (µl)	2	20	40	100
Recycling Mix Working Solution (µl)	25	250	500	1250

注：由于Enzyme Solution A、Recycling Mix和Enzyme Solution B的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
d.DTNB工作液的配制：取适量的DTNB (5X)，按照1:4的比例用Glucose Uptake Assay Buffer稀释成1X DTNB工作液。例如10μl DTNB (5X)中加入40μl Glucose Uptake Assay Buffer混匀即为50μl DTNB工作液。
2.细胞样品的准备(以96孔板为例)。
本实验方案针对油酸诱导的HeLa细胞进行举例说明，油酸诱导方案仅供参考。对于其它类型的细胞如分化的3T3-L1脂肪细胞、肌肉细胞或肝脏细胞等，最佳孵育时间和处理方案可能会有所不同。
a.接种细胞。按照每孔1万个细胞量加入96孔板中，培养箱继续培养24小时。
b.油酸诱导HeLa细胞。PBS洗涤细胞1次，每孔加入100μl含有800μM油酸的完全培养液，培养箱继续培养24小时。推荐使用油酸(≥99%, Cell Culture Grade) (ST2053)。
c.PBS洗涤细胞2次，每孔加入100μl无血清低糖培养液，培养过夜。
注1：也可使用无糖培养液，使用无糖培养液处理不应超过6个小时，以避免造成细胞损伤。推荐碧云天的低糖或无糖DMEM培养液(C2712/C2715)或无糖RPMI 1640培养液(C2727)。
注2：对于分化的3T3-L1脂肪细胞等，仅需要无血清培养液饥饿处理即可。无血清培养时间可根据实际细胞状态进行调整。
d.次日，PBS洗涤细胞3次。每孔加入100μl KRPH Buffer，37ºC孵育40分钟，使细胞进一步缺乏葡萄糖。
注：步骤2a-2d仅供参考，对于具体拟检测的细胞样品，可以任意自行设置。
e.对照和样品组的设置。
(a)背景对照组。无需进行胰岛素或根皮素等处理，也无须加入2-DG。
注：必须设置背景对照组，以消除细胞内源性G6P、NADP+、GSH等的干扰。
(b)(选做)阳性和阴性对照组。加入胰岛素至合适的终浓度(如100μg/ml)作为阳性对照，或加入抑制剂(如终浓度为150μM的根皮素)作为阴性对照，孵育20分钟。随后加入10μl 2-DG (10mM)，孵育20分钟。
注1：加入胰岛素可刺激细胞快速摄取葡萄糖。
注2：产生胰岛素耐受的细胞在添加胰岛素刺激后，细胞的葡萄糖摄取能力会减弱。
(c)样品组。目的药物等处理适当时间后，加入10μl 2-DG (10mM)，孵育20分钟。
注：对于一些葡萄糖摄入比较缓慢的细胞，阳性和阴性对照组以及样品组加入2-DG后的孵育时间可以延长到例如60分钟，同时也可以考虑把2-DG的加入量加倍，即可以考虑加入20μl 2-DG (10mM)。通过上述两种操作可以提高葡萄糖摄取的检测灵敏度。
f.使用PBS洗涤细胞3次，每孔加入100μl Glucose Uptake Lysis Buffer，适当吹打，充分裂解细胞。4ºC，14,000×g离心5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作，制备好的细胞裂解液样品如果不能立即检测，可以短期保存于-20ºC或-80ºC。推荐碧云天的BeyoFuge™ 1524R高速台式冷冻离心机(15000rpm, 24孔) (E6943)。
3.组织样品的准备。
a.实验动物处理和2-DG摄入。小鼠等实验动物进行适当的药物处理或遗传操作后注射或灌胃适量的2-DG，同时必须设置未注射或灌胃2-DG的背景对照组。同时推荐设置适当的阴性和阳性对照。推荐注射或灌胃等摩尔数的葡萄糖后不会显著影响血糖水平为宜，这样外源进入体内的2-DG对于体内正常的糖代谢干扰较小。
b.组织样品采集。根据具体的实验设计，可以酌情考虑在注射或灌胃2-DG例如30分钟、60分钟或120分钟后采集目的组织样品，同时采集背景对照组的组织样品。
c.组织样品的制备。使用Glucose Uptake Lysis Buffer按照1:10的比例(10mg组织样品使用100μl Glucose Uptake Lysis Buffer)进行匀浆和裂解，随后4ºC，14,000×g离心5分钟，取上清用于后续检测。推荐碧云天的BeyoFuge™ 1524R高速台式冷冻离心机(15000rpm, 24孔) (E6943)。
4.样品测定。
a.2-DG6P标准曲线设置：取1μl 2-DG6P Standard (1mM)，加入249μl Glucose Uptake Assay Buffer，混匀，配制成浓度为4μM的2-DG6P标准溶液。分别取4μM 2-DG6P标准溶液0、1.25、2.5、5、10、15、20、25μl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用Glucose Uptake Assay Buffer补足至25μl，此时，标准曲线的浓度和物质的量分别为0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4μM和0、5、10、20、40、60、80、100pmol。
b.取1-25μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入Glucose Uptake Assay Buffer至样品孔中，补足至25µl。
注：为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中2-DG6P的大致浓度，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为5µl，则n=10×25/5=50)。
c.每孔加入20μl Reaction Mix反应工作液，混匀，37ºC避光反应60分钟。
d.每孔加入5μl Stop Buffer，混匀，70ºC避光反应60分钟。
e.每孔加入5μl GR Buffer，混匀。
f.每孔加入25μl Recycling Mix反应工作液，混匀。
g.每孔加入20μl DTNB工作液，混匀。
h.37ºC反应30-60分钟，每5分钟测定一次A412，直至最高浓度标准品孔(100pmol)的信号值达到1.5-2左右。
注1：通常情况下，本试剂盒孵育35分钟左右，最高浓度标准品孔(100pmol)的信号值可以达到1.5左右，孵育45分钟左右，高浓度标准品孔(100pmol)的信号值可以达到2左右。
注2：为取得最佳的检测结果，反应时间也可以根据待测样品中2-DG的含量进行调整，但是必须确保读数在标准曲线范围内。可以进行动力学检测，对于2-DG含量较高的样品，测定总时间可以设为30分钟，对应的测定间隔时间设为5分钟；对于2-DG含量较低的样品，测定时长设为1小时，对应的测定间隔时间设为10分钟。也可以连续测定60分钟，每隔5分钟测定1次，最后取合适的时间点的数据用作分析和计算。
i.建立标准曲线，并计算样品中2-DG6P的浓度(A)，如果样品的背景对照组信号比较高，样品的信号值应减去样品背景对照的信号值。2-DG6P标准曲线可以参考图2A，在1-100pmol浓度范围内有良好的线性关系。2-DG摄入量计算公式如下：
C(pmol)=A×n
注：A为步骤4i根据标准曲线确定的2-DG6P浓度(pmol)；
n为步骤4b样品总稀释倍数。
参考文献：
1.Scoditti E, Sabatini S, Carli F, Gastaldelli A. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2024. 21(5):319-334.
2.Jones JG. Diabetologia. 2016. 59(6):1098-103.
3.Bose S, Le A. Glucose Metabolism in Cancer. Adv Exp Med Biol. 2018. 1063:3-12.
4.Walker-Samuel S, Ramasawmy R, Torrealdea F, Rega M, Rajkumar V, et al. Nat Med. 2013. 19(8):1067-72.
5.Hay N. Nat Rev Cancer. 2016. 16(10):635-49.
6.Sylow L, Kleinert M, Richter EA, Jensen TE. Nat Rev Endocrinol. 2017. 13(3):133-148.
7.Yamamoto N, Sato T, Kawasaki K, Murosaki S, Yamamoto Y. Anal Biochem. 2006. 351(1):139-45.
8.Yamamoto N, Ashida H. Food Sci Technol Res. 2012. 18:498-503.
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