使用说明：
1.Rhod-2染色液(Rhod-2 Staining Solution)的配制。
按照96孔板每孔100μl Rhod-2染色液的体系，参考下表配制适量的Rhod-2染色液，并充分混匀。不同多孔板的试剂用量请按比例调整。

Reagent	1 Sample	10 Samples	100 Samples
Rhod-2 AM (500X)	0.2μl	2μl	20μl
Solubility Enhancer (500X)	0.2μl	2μl	20μl
Assay Buffer	99.6μl	996μl	9.96ml
Rhod-2 Staining Solution	100μl	1ml	10ml

注1：配制好的Rhod-2染色液必须一次性使用完毕，不能冻存。本试剂盒提供的Rhod-2 AM为500X储存液，推荐的最终使用浓度经过优化，对大多数细胞都适用，但为了得到更满意的检测结果，对于不同类型的细胞请自行进行一定摸索，Rhod-2 AM的终浓度通常为0.5X-2.5X，最优先的推荐终浓度为1X。另外，Rhod-2 AM浓度的增加很可能会使线粒体发生浓度依赖性的裂变，导致线粒体特有的长小管断裂，产生圆形的小线粒体[7]。因此建议Rhod-2 AM的工作浓度不超过2.5X，否则可能会改变线粒体形态。
注2：也可以使用其它合适的溶液，如无血清培养液、HBSS (C0218)或PBS (C0221A/C0221D)稀释Rhod-2 AM (500X)。本试剂盒配套提供的检测缓冲液(Assay Buffer)可在一段时间内有效维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，使用效果通常比PBS或HBSS更好。
注3：Staining Enhancer即染色增强剂，对细胞功能可能有一定的影响，对于大多数细胞无需添加。如果遇到细胞出现去酯化的荧光探针Rhod-2明显的外排现象时，则建议添加。使用时将Staining Enhancer (100X)按照1:100稀释到Rhod-2 Staining Solution中，配制成含1X Staining Enhancer的Rhod-2 Staining Solution。细胞在含1X Staining Enhancer的溶液中孵育的时间不能超过2小时。
2.阳性对照的设置。
把试剂盒中提供的CaUp (500X)推荐按照1:500的比例加入到细胞培养液中，孵育30分钟。随后按照下述方法加入Rhod-2染色液，进行线粒体内钙离子浓度的检测。对于大多数细胞，通常CaUp (1X)处理30分钟后线粒体内钙离子超载，Rhod-2 AM染色后观察应呈现较强的红色荧光；而正常的细胞经Rhod-2 AM染色后应呈现微弱的红色荧光。对于特定的细胞，CaUp作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行摸索最佳工作浓度作用时间，甚至某些细胞可能对CaUp不敏感而某些细胞却受到损伤。
3.对于悬浮细胞。
a.细胞按照实验设计进行一定处理后，酌情取约10-100万细胞600×g室温离心5分钟，弃上清，加入适当体积的Rhod-2染色液重悬细胞，使细胞密度为100万-1000万/ml。
b.细胞培养箱中37ºC孵育10-30分钟，不同的细胞最佳孵育时间不同。以20分钟作为初始孵育时间，根据作用细胞对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。
c.37ºC孵育结束后，600×g 4ºC离心3-4分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。
d.用PBS洗涤2次：加入1ml PBS重悬细胞，600×g 4ºC离心3-4分钟，弃上清。再加入1ml PBS重悬细胞，600×g 4ºC离心3-4分钟，弃上清。
e.再用适量PBS重悬细胞后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。也可以根据实验需要在细胞重悬后加入适当药物处理并进行相应的荧光检测。
4.对于贴壁细胞。
注：对于贴壁细胞，如果希望采用流式细胞仪检测，可以先消化并收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
a.对于96孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次。如果使用其它的多孔板，各种试剂的用量需要相应按比例调整。
b.加入100μl Rhod-2染色液。细胞培养箱中37ºC孵育10-30分钟，不同的细胞最佳孵育时间不同。以20分钟作为初始孵育时间，根据作用细胞对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。
c.37ºC孵育结束后，吸除上清，用PBS洗涤2次。
d.加入100μl PBS，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。加入PBS后也可以根据实验需要加入适当药物处理并进行相应的荧光检测。如果考虑使用荧光酶标仪检测，优先推荐使用碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)，分别进行顶读或底读模式进行荧光检测。
5.参数设置。
使用552nm激发波长，581nm发射波长，实时、逐时间点或单时间点检测刺激前后荧光的强弱。Rhod-2 AM和钙离子的反应产物的荧光光谱和碘化丙啶(PI)或Cy3丙非常相似，可以用检测Phycoerythrin (PE)的参数设置进行检测。
参考文献：
1.Bravo-Sagua R, Parra V, López-Crisosto C, Díaz P, Quest AF, et al. Compr Physiol. 2017. 7(2):623-634.
2.Feissner RF, Skalska J, Gaum WE, Sheu SS. Front Biosci (Landmark Ed). 2009. 14(4):1197-1218.
3.Pendin D, Greotti E, Filadi R, Pozzan T. J Endocrinol Invest. 2015. 38(1):39-45.
4.Minta A, Kao JP, Tsien RY. J Biol Chem. 1989. 264(14):8171-8178.
5.Jean-Quartier C, Bondarenko AI, Alam MR, Trenker M, et al. Mol Cell Endocrinol. 2012. 353(1-2):114-127.
6.Kosmach A, Roman B, Sun J, Femnou A, et al. Cell Rep. 2021. 37(3):109846.
7.Fonteriz RI, de la Fuente S, Moreno A, Lobatón CD, Montero M, et al. Cell Calcium. 2010. 48(1):61-69.
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