碧云天的铁离子与亚铁离子检测试剂盒(显色法) (Ferric and Ferrous Ion Assay Kit, Colorimetric)，又称Ferrous Ion Assay Kit、Iron Ion Assay Kit、Iron Test Kit、铁离子含量检测试剂盒、总铁离子检测试剂盒或铁离子检测试剂盒，是一种利用吸光度检测方法，快速、高灵敏地对血清、血浆、组织、细胞以及组织裂解液样品中总铁离子、三价铁离子(高铁)或二价铁(亚铁)离子含量进行高灵敏度检测的试剂盒。

铁(Iron)是人体中丰度较高的必需微量元素之一[1]，通常以两种生物学相关状态存在，即还原态的二价铁离子(Fe2+, Ferrous Ions)，也称亚铁离子，和氧化态的三价铁离子(Fe3+, Ferric Ions)，两种状态间氧化还原循环的平衡有助于铁作为酶和蛋白分子等活性所需的辅助因子，以维持酶和蛋白分子等正常生物学功能[2]。此外，铁是人体蛋白质合成重要原料，含铁蛋白质是细胞和机体功能所必需的，如氧气运输、核酸复制和修复、线粒体呼吸、宿主防御等[3]。因此，铁对于生物体的生存至关重要。当铁含量过低或过高时均会损害机体，从而导致疾病的产生。铁含量过低时，人体可能会出现缺铁性贫血、异食癖等；铁含量过高时，人体可能会出现急性或慢性铁中毒，损害多个器官等[4]。因此，检测铁离子含量对于防治铁相关疾病具有重要意义。

检测溶液中亚铁离子含量的方法有硫氰化钾法、硝酸银法、铁氰化钾法等，其中硫氰化钾法和硝酸银法对亚铁离子检测灵敏性低、干扰因素多；铁氰化钾法中铁氰化钾有毒性，在强酸条件下会产生剧毒气体氰化氢。本试剂盒采用探针法，该探针(Iron Probe)是一种无味、无毒的用于高灵敏检测溶液中亚铁离子含量。Iron Probe可与亚铁形成紫色络合物，该络合物在593nm处有强吸收峰，可以利用吸光度进行检测。

本试剂盒的检测原理请参考图1。在酸性条件下，铁从复合物中(如Transferrin)解离出来，然后使用还原剂(Reduction Buffer)将三价铁离子还原为亚铁离子。Iron Probe与亚铁离子形成紫色络合物，通过酶标仪检测593nm处吸光度，再使用本试剂盒提供的Iron Standard，通过设置标准曲线计算出样品中总铁含量。如需检测样品中亚铁离子含量，则直接加入Iron Probe，而无须加入Reduction Buffer，通过酶标仪检测593nm处的吸光度，再通过标准曲线计算就可获得样品中亚铁离子含量。最后通过总铁离子与亚铁离子含量的差值就能间接计算出三价铁离子含量。

图1.碧云天铁离子与亚铁离子检测试剂盒(显色法) (S1066)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽。本试剂盒在标准品体积为100µl时，可以检测浓度低至0.8µΜ的铁离子，在0.8-50μM (0.08-5nmol)，即约0.044-2.8mg/L (Fe)浓度范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了Iron Standard标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2)，计算出样品中的铁离子含量。

图2.碧云天铁离子与亚铁离子检测试剂盒(显色法) (S1066)用于标准品检测的效果。取100µl用Assay Buffer稀释的各浓度的Iron Standard与20µl的Reduction Buffer混匀后，加入5µl Decontamination Solution，并用Assay Buffer补齐至190µl，37ºC避光反应30分钟。再加入10µl Iron Probe混匀，37ºC避光反应30分钟，然后进行吸光度检测。图A为0-100µM的标准曲线，图B为0-50µM的标准曲线，在0.8-50µM (约0.044-2.8mg/L)浓度范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒特异性高，应用范围广，检测速度快。本试剂盒经过优化，可有效屏蔽常见金属离子如Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+等的干扰，而且本试剂盒提供Decontamination Solution，可有效消除含脂质较多的组织样品出现的白色浑浊物。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞样品等的检测。本试剂盒不仅适合少量样品的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。整个检测过程约1个小时即可完成。本试剂盒用于血清、动物组织及细胞样品中铁离子的检测效果请参见图3和图4。

图3.碧云天铁离子与亚铁离子检测试剂盒(显色法) (S1066)用于不同血液或组织样品中铁离子浓度的检测效果图。图A为兔血清(Rabbit serum)、胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)总铁离子浓度检测，图B为小鼠肝脏(Liver)和脾脏(Spleen)样品中总铁离子及亚铁离子浓度的检测效果图。对于总铁离子的检测，取50µl样品和20µl的Reduction Buffer混匀后，加入5µl Decontamination Solution，并加入Assay Buffer补齐至190µl，37ºC避光反应30分钟，直至样品孔中液体清澈透亮。再加入10µl Iron Probe混匀，37ºC避光反应30分钟，随后进行吸光度检测可获得总铁OD值，根据标准曲线计算出样品总铁浓度。对于亚铁检测则上述步骤无需加入Reduction Buffer。如需获得样品中三价铁含量，使用总铁离子与亚铁离子浓度的差值就能间接计算出三价铁离子浓度。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

图4.碧云天铁离子与亚铁离子检测试剂盒(显色法) (S1066)用于不同细胞样品中铁离子浓度的检测效果图。图A和图C分别为HepG2和HeLa细胞培养液中添加不同浓度硫酸亚铁铵(Ferrous Ammonium Sulfate)培养24小时后，细胞内铁离子浓度的检测；图B和图D分别为HepG2和HeLa细胞培养液中添加不同浓度的Erastin (Ferroptosis诱导剂) (SC0224)，诱导培养48小时后，细胞内铁离子浓度的检测。总铁离子和亚铁检测方法同图3，细胞样品为100µl细胞裂解液(约100万个细胞)使用本试剂盒进行检测。图中的浓度为nmol铁离子/毫克蛋白。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

按照使用说明操作，本试剂盒小包装可以进行100次检测，中包装可以进行500次检测。

-20ºC保存，一年有效。Iron Standard (50mM)和Iron Probe须避光保存。

需自备1M盐酸。

对于未知铁离子浓度样品的检测，建议设置一系列稀释梯度，以确保读数在标准曲线范围内。

须设置空白对照组以排除样品本身的颜色带来的影响。

本试剂盒检测时涉及氧化还原反应，因此所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定。

本试剂盒最终反应体系的pH值约4.5。请确保样品的pH值接近中性，过酸或过碱都会影响试剂盒的检测。如果发现有异常，请检测一下反应体系的最终pH值是否在4.5左右，过高或过低都可以视为异常，此时需要调整样品的pH值接近中性。

请确保样品和使用到的试剂中均不能含有EDTA等螯合剂，EDTA会干扰铁离子的检测。

由于一些细胞中Fe2+含量非常低，且Fe2+在检测过程中可能逐渐被氧化为Fe3+，导致Fe2+不能被检测到，甚至为负值。建议适当提高细胞的数量，并且尽量减少样品暴露在空气中的时间，尽快进行测定。

涉及的所有的实验器皿不能含有铁。对于血液样品需确保在样品收集过程中无溶血发生。

经测试，本试剂盒相对稳定，检测所得的Iron标准曲线的线性范围等通常和说明书中的描述一致，但是实际效果可能会因为实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，例如最高浓度点的数据偏低或不在线性范围内等，通常可以舍去高浓度异常点的数据，取在线性范围内的数据来拟合标准曲线。

血清、血浆等样品如在4ºC保存，保存的时间不得超过一周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品在-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

酶标仪检测时须使用适合显色法检测的透明孔板，推荐选购碧云天的BeyoGold™ 96孔细胞培养板(FCP962)或96孔板(平底, 带盖) (FPT010/FPT011)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。