碧云天的Beyo3D™一氧化氮检测试剂盒(DAF-FM DA) (Beyo3D™ Nitric Oxide Assay Kit with DAF-FM DA)，是一种以DAF-FM DA为荧光探针，快速、便捷、高灵敏地检测3D培养的细胞球或类器官内一氧化氮含量变化的试剂盒。仅需染色20分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的细胞球或类器官内一氧化氮绿色荧光染色。本试剂盒可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪等荧光检测设备进行检测。

一氧化氮(Nitric oxide)是一种无机氮氧化合物，作为一种反应性自由基，因其分子量小且具有亲脂性，可快速扩散通过生物膜，可作为信号分子将一个细胞产生的信号传递给周围的细胞，具有舒张血管、调节免疫、抑制炎症反应、参与调节神经元兴奋性和神经递质的释放、DNA的修复和保护等功能，在神经系统、免疫系统、心血管系统、细胞凋亡等重要生理过程中发挥着不可或缺的作用[1-3]。

DAF-FM DA，即3-Amino,4 aminomethyl 2',7'-difluorescein, diacetate，也称DAF-FM diacetate或4-Amino,5 aminomethyl-2',7'-difluorescein, diacetate。DAF-FM DA是新一代用于一氧化氮定量检测的荧光探针，比以前比较常用的一氧化氮荧光检测探针DAF-2 diacetate有多方面的改进。首先，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，最后和一氧化氮反应形成的荧光产物受pH值的影响小，在pH值大于5.5时不受pH值的影响。其次，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，前者产生的荧光更加稳定，不容易淬灭，这样更加便于检测。另外，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，前者对一氧化氮的检测灵敏度更高，相同条件下检测灵敏度可以提高接近2倍，最低检测浓度可以达到3nM [4-5]。

DAF-FM DA可以穿过细胞膜(Cell-permeable)，进入细胞后可以被细胞内的酯酶催化形成不能穿过细胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身仅有很弱的荧光，但在和一氧化氮反应后可以产生强烈荧光，激发波长为495nm，发射波长为515nm。任何可以检测Fluorescein绿色荧光的仪器，包括荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计或荧光酶标仪都可以用于本荧光探针的检测。

本试剂盒提供的DAF-FM DA为1000X储存液。DAF-FM DA的终浓度通常为0.2-2X，最优先的推荐终浓度为1X。

本试剂盒提供了诱导细胞产生一氧化氮的阳性对照试剂Beyo3D™ NOup。本试剂盒提供的Beyo3D™ NOup为1000X的储存液，推荐终浓度为0.5-2X，最优先的推荐终浓度为1X。同时，本试剂盒提供了Beyo3D™ DAF-FM DA Assay Buffer，使用更便捷。使用本试剂盒检测HCT-116 (人结肠癌细胞)细胞球内一氧化氮的效果参考图1。

图1.碧云天Beyo3D™一氧化氮检测试剂盒(DAF-FM DA) (S1122)检测3D培养的HCT-116 (人结肠癌细胞)一氧化氮的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用碧云天3D细胞培养包被试剂盒(U形底96孔板) (C0366)包被的U形底96孔板中培养72小时，1X Beyo3D™ NOup诱导细胞球30分钟，然后吸除培养液后直接加入1X的Beyo3D™ DAF-FM DA检测工作液，染色20分钟。结果显示，Beyo3D™一氧化氮检测试剂盒(DAF-FM DA)对于Beyo3D™ NOup诱导后的3D细胞染色效果清晰、明亮，Beyo3D™ DAF-FM DA染色的对照组细胞无明显阳性染色(B、F)，Hoechst 33342染色的细胞核总体基本一致(C、G)。Beyo3D™ Hoechst 33342染色液(C1345)需自备。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本试剂盒适用范围广。本试剂盒可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrix-Gel™基质胶或Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。

本试剂盒使用便捷，整个检测过程仅需约20分钟即可完成。3D细胞球经一氧化氮阳性对照试剂Beyo3D™ NOup等诱导处理后，将本试剂盒中的Beyo3D™ DAF-FM DA (1000X)按照相应比例用Beyo3D™ DAF-FM DA Assay Buffer配制成Beyo3D™ DAF-FM DA检测工作液，避光孵育20分钟，就可进行后续的荧光显微镜拍照等荧光检测和分析。

传统的细胞培养大多以二维(Two-dimensional, 2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低[6-8]。三维(Three-dimensional, 3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实的反映细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果[9-10]。

3D肿瘤细胞模型越来越多地被用于了解疾病机制和药物研发。2D培养的肿瘤细胞，其单侧细胞膜可以均匀地获得营养和氧气，而3D培养的肿瘤细胞团的内部细胞获得营养和氧气的机会更少，形成自然的营养和氧气梯度，能更好地模拟体内微环境条件，因此3D培养的肿瘤球状体(Spheroid)或肿瘤类器官(Organoid)等能更好地模拟体内肿瘤，更利于小分子药物筛选或者肿瘤相关分子机制的研究，也更能准确地预测药物治疗的体内反应、疗效或毒性。同时，2D肿瘤细胞模型体外扩增有一定局限性，在传代后容易丧失原肿瘤的遗传异质性，出现优势克隆选择性，从而降低临床相关性。相比于2D细胞模型，3D细胞球或者类器官很多情况下能提供更可信的研究结果，简化并加速药物评价流程。自2009年小肠类器官首次建立至今，3D细胞和类器官研究已经扩展到很多组织系统，并成为生命科学最热门的领域之一。

按照96孔板每孔需要100μl Beyo3D™ DAF-FM DA检测工作液，本试剂盒小包装可以进行200个样品的检测，中包装可以进行1000个样品的检测。

-20ºC保存，一年有效。其中Beyo3D™ DAF-FM DA (1000X)和Beyo3D™ NOup (1000X)须避光保存。

Beyo3D™ DAF-FM DA (1000X)和Beyo3D™ NOup (1000X)第一次使用时请分装成小包装后-20ºC保存，避免反复冻融。

荧光探针应随用随配。配制好的Beyo3D™ DAF-FM DA检测工作液应立即使用，不能以后再用。

Beyo3D™ DAF-FM DA (1000X)在4ºC、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25ºC水浴温育片刻至全部融解后使用。

BSA和酚红(Phenol red)对Beyo3D™ DAF-FM DA的检测有干扰，需避免。

细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。

不同种类的细胞球对诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经Beyo3D™ NOup诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

本试剂盒仅限于进行存活的细胞或组织的检测，不可用于固定或冻存的细胞或组织样品的检测。

Beyo3D™ DAF-FM DA Assay Buffer经过过滤除菌处理，在使用时须注意避免微生物污染，否则很可能影响染色效果。如果Beyo3D™ DAF-FM DA Assay Buffer发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™超低吸附黑色透明底96孔板(平底带盖, 独立包装) (FULA965)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。